Olgun miRNA'nın uzunluğu yalnızca yaklaşık 20nt'dir, genellikle ileri primer tüm uzunluğunu kaplar veya hatta fazla bir parçaya sahip olur ve ters primerin yerleştirilecek hiçbir yeri olmaz. Mevcut pazar çözümü, ters transkripsiyon sırasında ters transkriptin uzunluğunu artırmaktır. Yaygın yöntemler arasında kuyruklama yöntemi ve sap-döngü yöntemi bulunur.

1. Giriş
2. Önerilen Ürünler
3. İlgili ürün listesi

1. Giriş

MikroRNA'lar (miRNA'lar), Dicer enzimi işlemi sonrasında yaklaşık 70-90 bazlık saç tokası yapısına sahip tek zincirli RNA öncüllerinden üretilen, yaklaşık 21-23 baz büyüklüğünde tek zincirli küçük RNA'lardır. miRNA esas olarak hedef gen mRNA'sının 3'-ucundaki kodlamayan bölgeye spesifik olarak bağlanır ve transkripsiyon sonrası hedef gen mRNA'sının translasyon sürecini düzenler, böylece mRNA translasyonunu bloke eder ve mRNA bozunmasını teşvik ederek protein ekspresyonunun azalmasına neden olur. miRNA'ların rolü, ontogeni, doku farklılaşması, hücre çoğalması ve apoptozis gibi çeşitli kardiyovasküler hastalıkların oluşumunda ve gelişiminde rol oynar.

Şekil 1. Vivo'da miRNA sentezinin şematik diyagramı

Olgun miRNA'nın uzunluğu yalnızca yaklaşık 20nt'dir, genellikle ileri primer tüm uzunluğunu kaplar veya hatta fazla bir parçaya sahip olur ve ters primerin yerleştirilecek hiçbir yeri olmaz. Mevcut pazar çözümü, ters transkripsiyon sırasında ters transkriptin uzunluğunu artırmaktır. Yaygın yöntemler arasında kuyruklama yöntemi ve sap-döngü yöntemi bulunur.

Şekil 2. Kuyruklama yöntemi ile miRNA sentezi

Şekil 3. Sap-döngü yöntemi ile miRNA sentezi

Kuyruklama yöntemi, olgun miRNA'ya Poly(A) kuyruğu eklemek için PolyA polimeraz kullanır ve ters transkripsiyon primeri olarak evrensel diziyle Oligo-dT'yi kullanarak cDNA'nın ilk ipliğine karşılık gelen uzatılmış miRNA'yı sentezler. Sap-döngü yöntemi, uzatılmış miRNA'ya karşılık gelen cDNA'nın ilk ipliğini sentezlemek için primer olarak sap-döngü yapısına katlanmış evrensel diziyi kullanır. Sap-döngü yapısı, sonraki amplifikasyon işlemi sırasında uygun bir sıcaklıkta açılacaktır. ve ilgili amplifikasyon primerleri ile birleştirildi.

Tablo 1.Kuyruk ve Sap Döngüsünün Karşılaştırılması

2. Önerilen Ürünler

2.1 Yeasen miRNA kuyruklu inversiyon kantitatif kombinasyonu (11148ES&11171ES)

Şekil 4. 11148ES-Hifair™ miRNA 1. Zincir cDNA Sentez Kiti

Kit, miRNA birinci zincir cDNA'sının ters transkripsiyonunu sağlamak için kuyruklama yöntemini benimser. Üründeki 2×Hifair™ miRNA RT tamponu, miRNA kuyruklama reaksiyonu ve ters transkripsiyon reaksiyonu için tüm ham maddeleri ve primerleri içerir ve dikkatlice optimize edilmiştir. miRNA 3' ucunun poli(A) modifikasyonu ve ters transkripsiyon süreçlerinin aynı anda verimli bir şekilde gerçekleştirilmesini sağlayabilir.

Şekil 5. 11171ES -Hieff™ miRNA Evrensel qPCR SYBR Ana Karışımı

Özel olarak miRNA kantitatif tespiti için geliştirilen, özel ROX Pasif Referans Boyası içeren, tüm qPCR cihazları için uygun, farklı cihazlarda ROX konsantrasyonunu ayarlamaya gerek kalmadan, sadece hazırlama reaksiyonunda yeni nesil önceden karıştırılmış floresan kantitatif PCR tespit reaktifleri. Amplifikasyon, sisteme primerler ve şablonlar eklenerek gerçekleştirilebilir. DNA polimeraz, kimyasal olarak modifiye edilmiş sıcak başlatma polimerazını benimser ve reaksiyon özgüllüğünü ve hassasiyetini daha yüksek hale getiren ve daha geniş bir aralıkta doğru bir şekilde kantifize edebilen özel bir Tampon sistemiyle işbirliği yapar.

2.2 Ürün performansı

2.2.1 Tüm platformlardaki qPCR cihazlarıyla uyumludur

Şekil 6. Farklı qPCR cihazlarıyla uyumlu sonuçlar

293T hücrelerinin Toplam RNA'sı şablon olarak kullanılarak, ters transkripsiyon Hifair™ miRNA 1. Zincir cDNA Sentez Kiti (Kat# 11148ES) kullanılarak gerçekleştirildi.Elde edilen cDNA 10 kat seyreltildi ve daha sonra sırasıyla hsa-miR-let-7b-5p, hsa-miR-let-7c-5p ve U6'nın dahili referans genlerini tespit etmek için Hieff™ miRNA Universal qPCR SYBR Master Mix (Kat# 11171ES) kullanıldı.

2.2.2 Yüksek tespit oranı, 10 pg'ye kadar

Şekil 7. Amplifikasyon grafiği

Şekil 8. Amplifikasyon grafiği

Şablon olarak sentetik hsa-miR-let-7e-5p(a) ve 293T hücre Toplam RNA(b) kullanılarak sırasıyla aşağıdaki gradyanlara kadar seyreltildi: 60 kopya ila 606 kopya (6 gradyan) ve 10 pg-100 ng (5 gradyan), Hifair™ miRNA 1. Zincir cDNA Sentez Kiti (Kat# 11148ES) ile ters transkripsiyon yapıldı ve elde edilen cDNA, hsa-miR-let-7e -5p gen ekspresyonu için Hieff™ miRNA Universal qPCR SYBR Master Mix (Kat# 11171ES) ile tespit edildi.

2.2.3 Yüksek özgüllük, aynı ailedeki miRNA'lar arasındaki tek baz farklılıklarını ayırt edebilme

Şekil 9. miRNA'lar arasındaki tek baz farklılıklarını ayırt edin

İnsan hsa-let-7 ailesi, birbirinden farklı birkaç baz veya hatta sadece tek bir baz farkı olan birden fazla miRNA'ya sahiptir. Her Let-7 izoformu (hsa-miR-let-7a~Let-7i, has-miR-98) için sentetik miRNA'lar, Hifair™ miRNA 1. Zincir cDNA Sentez Kiti (Kat# 11148ES) kullanılarak cDNA'ya ters transkripsiyona tabi tutulmuş, Hieff™ miRNA Universal qPCR SYBR Master Mix (Kat# 11171ES) kullanılarak bu miRNA'lar farklı primerlerle ayrı ayrı çoğaltılmış ve Denklem 2-ΔCT x %100 kullanılarak eşleşme oranı hesaplanmıştır. Sonuçlar, yakından ilişkili alt tip aile üyelerinin etkili bir şekilde ayırt edilebileceğini göstermektedir.

2.2.4 Mükemmel amplifikasyon verimliliği

Şekil 10. Amplifikasyon verimliliği

Şekil 11. Amplifikasyon verimliliği

miR-let-7b-5p, miR-let-7c-5p, miR-let-7e-5p, miR-let-7f-5p genleri şablon olarak insan 293T hücreleri ve fare karaciğeri Total RNA kullanılarak çoğaltıldı. Sonuçlar, benzer ürünlerle karşılaştırıldığında Hifair™ miRNA 1. Zincir cDNA Sentez Kiti'nin (Kat# 11148ES) Hieff™ miRNA Universal qPCR SYBR Master Mix'in (Kat# 11171ES) reaksiyon sistemine mükemmel performansla uyduğunu gösterdi.

2.2.5 Mükemmel stabilite

Şekil 12. 7 gün boyunca 37℃'de ürün kararlılık analizi

Şekil 13. 50 dondurma-çözme döngüsünden sonra sonuçların analizi

Şekil 14. 24 saat boyunca farklı sıcaklıklarda kantitatif reaksiyon sisteminin kararlı analitik özellikleri

Ters transkripsiyon, şablon olarak 293T hücre Toplam RNA'sı kullanılarak Hifair™ miRNA 1. Zincir cDNA Sentez Kiti (Kat# 11148ES) ile gerçekleştirildi ve elde edilen cDNA 10 kat seyreltildi ve Hieff™ miRNA Evrensel qPCR SYBR Ana Karışımı (Kat# 11171ES) ile tespit edildi. hsa-miR-let-7b-5p, hsa-miR-let-7c-5p, hsa-miR-let-7e-5p ekspresyonu. △Ct<0,5.

2.3 Yeasen miRNA kök-döngü inversiyonu kantitatif kombinasyonu (11139ES&11170ES)

Şekil 15. 11139ES-Hifair™ III 1. Zincir cDNA Sentez Kiti (gDNA sindirici artı)

Kit, Hifair™ III Ters Transkriptaz temel alınarak geliştirilmiştir.Enzim cDNA sentez hızı hızlıdır ve termal kararlılık büyük ölçüde iyileştirilmiştir. Aynı zamanda, enzim şablonla afiniteyi artırır ve az miktarda şablonun ve düşük kopya genlerinin ters transkripsiyonu için uygundur. Hifair™ III Ters Transkriptazın tam uzunlukta cDNA sentezleme yeteneği de iyileştirilmiş olup, 19,8 kb'ye kadar cDNA sentezlenmesine olanak sağlamıştır.

Şekil 16. 11170ES-Hieff™ miRNA Evrensel qPCR SYBR Ana Karışımı

Bu ürün, SYBR Green I kimerik floresan yöntemi kullanılarak miRNA kantifikasyonu için özel bir ana karışımdır. miRNA dizileri kısa olduğundan ve aynı ailedeki miRNA dizileri sıklıkla oldukça benzer olduğundan, kantifikasyon sırasında özgüllük son derece gereklidir. Bu ürün, spesifik olmayan amplifikasyonu büyük ölçüde azaltabilen optimize edilmiş Tampon ile sıcak başlatmalı DNA polimerazına dayanmaktadır; aynı zamanda, özel ROX Referans Boyası ana karışımı tüm qPCR cihazları için uygun hale getirir ve farklı cihazlarda ROX'u ayarlamaya gerek yoktur. Amplifikasyon, reaksiyon sistemini hazırlarken primerler ve şablonlar eklenerek gerçekleştirilebilir.

2.3.1 Tüm platformlardaki qPCR cihazlarıyla uyumludur

Şekil 17. Farklı qPCR cihazlarıyla uyumlu sonuçlar

Fare karaciğer hücrelerinin toplam RNA'sı şablon olarak kullanılarak, ters transkripsiyon Hifair™ III 1. Zincir ile gerçekleştirildi
cDNA Sentez Kiti (gDNA digester plus) (Kat# 11139ES) ve elde edilen cDNA 40 kat seyreltildi ve Hieff™ miRNA Universal qPCR SYBR Master Mix (Kat# 11170ES) kullanılarak insan mmu-miR-125a geninin çoğaltılması gerçekleştirildi.

2.3.2 Yüksek hassasiyet, 10 pg'ye kadar

Şekil 18. Hassasiyet tespiti

Fare karaciğer hücrelerinin toplam RNA'sı şablon olarak kullanılarak, ters transkripsiyon Hifair™ III 1. Zincir cDNA Sentez Kiti (gDNA digester plus) (Kat No. 11139ES) ile gerçekleştirildi ve elde edilen cDNA seri olarak 10 kat seyreltildi (aralığı 10pg/μL). -0,1 μg/μL), fare kökenli mmu-miR-125a, mmu-miR-132 ve mmu-miR-351 genlerini çoğalttı.

2.3.3 Yüksek özgüllük, aynı ailedeki miRNA'lar arasındaki tek baz farklılıklarını ayırt edebilme

Şekil 19. miRNA'lar arasındaki tek baz farklılıklarını ayırt edin

İnsan hsa-let-7 ailesi, birbirinden farklı birkaç baz veya hatta sadece tek bir baz farkı olan birden fazla miRNA'ya sahiptir. Bu miRNA'lar, Hieff™ miRNA Universal qPCR SYBR Master Mix (Cat# 11170ES) kullanılarak farklı primerlerle ayrı ayrı çoğaltıldı ve eşleşme oranı 2^-Δct x 100% formülü kullanılarak hesaplandı.

2.3.4 İyi tekrarlanabilirlik

Şekil 20. Tekrarlanabilirlik tespiti

İnsan 293T hücrelerinin Toplam RNA'sı ters transkripsiyon için bir şablon olarak kullanılarak, ters transkripsiyon Hifair™ III 1. Zincir cDNA Sentez Kiti (gDNA digester plus) (Kat# 11139ES) ile gerçekleştirildi ve elde edilen cDNA 50 kat seyreltildi ve Hieff™ miRNA Universal qPCR SYBR Master Mix (Kat# 11170ES) kullanılarak 90-kuyucuklu tekrar deneyinde insan hsa-let-7a geninin çoğaltılması sağlandı.

2.3.5 İyi stabilite

Şekil 21.11170ES'nin 14 gün boyunca farklı sıcaklıklarda kararlılık analizi

Şekil 22. 11170ES'nin tekrarlanan donma ve çözülme analizi

Şekil 23. 24 saat boyunca farklı sıcaklıklarda kantitatif reaksiyon sisteminin kararlı analiz özellikleri

Fare karaciğer hücrelerinin toplam RNA'sı, Hifair™ III 1. Zincir cDNA Sentez Kiti (gDNA digester plus) (Cat# 11139ES) ile ters transkripsiyon için bir şablon olarak kullanıldı. Elde edilen cDNA, fare mmu- miR-132 genini çoğaltmak için 100 kat seyreltildi.

3. İlgili ürün listesi

2014 yılında kurulan Yeasen Biotechnology (Shanghai) Co., Ltd., alet enzim hammaddeleri ve antijen antikorlarının Ar-Ge ve üretimiyle uğraşan bir yüksek teknoloji kuruluşudur. Ürünleri arasında moleküler tanı enzimleri, proteinler ve ilaçlarda, gıda güvenliği testlerinde, üremede, adalette ve diğer endüstrilerde kullanılan antikorlar yer almaktadır. Yaşam bilimleri alanındaki müşterilerimize yüksek kaliteli ürünler ve hizmetler sunmaya kararlıyız. Yeasen tarafından sağlanan ilgili ürünler şunlardır:

Tablo 2. İlgili ürün listesi