Doğrudan PCR, nükleik asit çıkarma ve nükleik asit saflaştırma adımları olmadan doğrudan kan, hayvan veya bitki dokusu vb.'yi amplifikasyon için kullanan bir reaksiyondur. DNA amplifikasyonuna benzeri görülmemiş bir kolaylık getirir ve bu da çok zaman kazandırabilir. Peki doğrudan PCR'de kullanılan reaktifler ve ürünler nelerdir?

1. Doğrudan PCR nedir?
2. Doğrudan PCR için hangi reaktiflere ihtiyaç vardır?
3. Doğrudan PCR Kitinin uygulama senaryoları ve özellikleri
4. Ürün Verileri
5. Müşteri Geri Bildirimi
6. Ürün Sipariş Bilgileri

1. Doğrudan PCR nedir?

Dünya çapında sayısız bilim insanı tarafından sürekli desteklenip geliştirildikten sonra, PCR teknolojisi tüm yaşam bilimleri alanında en yaygın kullanılan, en sık kullanılan ve en önemli temel araştırma yöntemi haline gelmiştir. Geleneksel PCR teknolojisinin geniş uygulamasına dayanarak geliştirilen Touch Down PCR, RT-PCR, Real-Time PCR, Multi PCR vb. ve en son Dijital PCR (Dijital PCR), bilimsel araştırmacıların çoğunluğunun araştırmalarını büyük ölçüde zenginleştirmiştir. Bu yöntemler, özellikle moleküler biyoloji olmak üzere modern yaşam bilimlerinin gelişimini büyük ölçüde hızlandırmış ve tüm insanlık için yaşam ve doğa araştırmalarına büyük katkılarda bulunmuştur. Geleneksel PCR teknolojisi ve ondan türetilen çeşitli yeni teknolojiler ve yeni uygulamaların bir ön koşulu vardır, yani yüksek saflıkta nükleik asit şablonlarının önceden elde edilmesi gerekir. Herhangi bir biyolojik numunenin, PCR'nin teknik gereksinimlerini karşılayan nükleik asit numuneleri elde etmek için bir dizi karmaşık ve sıkıcı numune işleme sürecinden geçmesi gerekir. DNA ve RNA'nın ayrılması ve çıkarılması, her zaman ilgili bilimsel ve teknik personelin her gün tekrarlaması gereken temel iş olmuştur. Örnekler arasındaki büyük fark nedeniyle, DNA ve RNA'nın ayrılması ve çıkarılması işlemi de oldukça farklıdır. Bu çalışma, operatörler için yüksek düzeyde teknik yeterlilik gerektirir. Geleneksel ayırma ve çıkarma teknolojisinde bazı oldukça toksik kimyasal reaktiflerin kullanılması nedeniyle, uzun süreli maruz kalma, operatörün vücudunda geri döndürülemez hasara ve hatta deney sırasında doğrudan hasara neden olacaktır. Fenol ve kloroform gibi kimyasal reaktifler laboratuvarda önemli kanserojenlerdir ve nükleik asit ayırma ve bitki dokularının çıkarılması sürecinde kullanılan sıvı nitrojen, ultra düşük sıcaklığı nedeniyle deney sırasında operatörlerin güvenliği için daha büyük bir tehdit oluşturur. Aynı zamanda, incelenecek çok sayıda örneği olanlar için, nükleik asitleri ayırmak ve çıkarmak emek yoğun bir iştir. Artık piyasadaki nükleik asit izolasyon ve çıkarma kitleri olgunlaştı ve birçok marka var, ancak hepsi aşağı yukarı aynı. İster silika membran kolon santrifüj kiti ister manyetik boncuk yöntemi kiti olsun, çok fazla zaman gerekir ve maliyeti yüksektir. Kitin maliyetine ek olarak, laboratuvar ekipmanı için özel gereksinimler vardır. Manyetik boncuk yönteminde kullanılan otomatik iş istasyonu, laboratuvar için büyük bir masraf olan çok tipik büyük ölçekli yüksek değerli bir ekipmandır. Özetlemek gerekirse, PCR deneyleri yapmadan önce, numune ön işlemi araştırmacılar için kaçınılmaz ve sürekli bir baş ağrısıdır. Bu sorunu nasıl çözeceğimiz ve nükleik asitlerin ayrılması ve çıkarılması olmadan doğrudan PCR deneyleri nasıl gerçekleştireceğimiz, birçok bilimsel araştırmacının ve klinik laboratuvar personelinin her zaman düşündüğü bir sorun olmuştur.

Doğrudan PCR, hayvan veya bitki dokularının nükleik asit ekstraksiyonu olmadan doğrudan amplifikasyon için kullanıldığı bir reaksiyondur. Birçok yönden, doğrudan PCR geleneksel PCR gibi çalışır.Temel fark, doğrudan PCR'de kullanılan özel tampondur. Örnek, nükleik asit ekstraksiyonu olmadan doğrudan PCR reaksiyonuna tabi tutulabilir, ancak doğrudan PCR reaksiyonunda yer alan enzimlerin toleransı ve tamponun uyumluluğu için karşılık gelen gereksinimler vardır. Yaygın örneklerde daha fazla veya daha az PCR inhibitörü olmasına rağmen, doğrudan PCR yine de enzimlerin ve tamponların etkisi altında güvenilir amplifikasyon sağlayabilir. Ancak, geleneksel PCR reaksiyonu, reaksiyon için bir şablon olarak yüksek kaliteli nükleik asit kullanmalıdır. Şablon proteinler ve diğer safsızlıklar içeriyorsa, PCR reaksiyonunun düzgün ilerlemesini engelleyecektir.

Doğrudan PCR'nin en erken uygulama alanı, farelerin, kedilerin, tavukların, tavşanların, koyunların, sığırların ve diğer hayvanların kanı, dokusu ve kılı gibi hayvan ve bitki alanıdır; bitkilerin yaprakları ve tohumları vb. Genotipleme, transgenik, plazmid tespiti, gen nakavt analizi, DNA kaynak tanımlaması, tür tanımlaması, SNP analizi ve diğer alanları incelemek için kullanılır. Bu alanların bazı ortak özellikleri vardır, yani hedef genin içeriği nispeten yüksektir ve nükleik asit ekstraksiyonu zahmetlidir. Bu nedenle, doğrudan PCR yalnızca zamandan tasarruf sağlamakla ve sonuçlar üzerinde çok az etkiye sahip olmakla kalmaz, aynı zamanda maliyetten de tasarruf sağlar.

2. Doğrudan PCR için hangi reaktiflere ihtiyaç vardır?

2.1 Örnek lizat

Örnek lizat kendiniz hazırlayabilir veya satın alabilirsiniz. Farklı lizat markalarının bileşenlerindeki fark, lizis yeteneğinin farklı olmasına ve ardından lizis süresinin biraz farklı olmasına neden olacaktır. Örneğin, hayvan doku örneklerinin hazırlanması için genellikle 30 dakika veya bir gece boyunca lizis yapılması önerilir ve virüsler için lizat 3-10 dakika arasında değişir.

2.2 PCR ana karışımı

Spesifik amplifikasyonu ve daha güçlü amplifikasyon yeteneğini geliştirmek için sıcak başlatmalı bir DNA polimeraz kullanılması önerilir. Doğrudan PCR'nin kalbinde oldukça dirençli bir polimeraz bulunur.

2.3 DNA amplifikasyonunu etkileyen numunelerdeki bileşenleri çıkarın veya engelleyin

Örnek lizat tarafından işlendikten sonra proteinler, lipitler ve diğer hücre artıkları serbest kalacak ve bu maddeler PCR reaksiyonunu engelleyecektir. Bu nedenle, doğrudan PCR'nin bu faktörlerin etkisini azaltmak için karşılık gelen uzaklaştırma veya inhibitörleri eklemesi gerekir.

3. Doğrudan PCR Kitinin uygulama senaryoları ve özellikleri

Yeasen'den Doğrudan PCR Kiti, bitki, hayvan dokusu veya kan örneklerini ve diğer orijinal örnekleri nükleik asit saflaştırması olmadan doğrudan çoğaltabilir ve bu da PCR deneysel sürecini büyük ölçüde basitleştirir. PCR tabanlı Genotipleme (Şekil 1), genom saflaştırması olmadan orijinal örnek kullanılarak (Şekil 1A) veya şablon olarak lizatı kullanılarak (Şekil 1B) gerçekleştirildi. Genel PCR tabanlı Genotipleme ile karşılaştırıldığında, doğrudan PCR kiti daha az örnek tüketimi, basit çalışma, düşük deneysel maliyet ve yüksek kaliteli kantitatif örnek tespiti sunar.

Şekil 1. Doğrudan PCR teknolojisi.

A. Doğrudan yöntem: Az sayıda örnek alın ve PCR tanımlaması için doğrudan PCR karışımına ekleyin. B. Lizis yöntemi: Genomu serbest bırakmak için örneği lizis çözeltisine ekleyin ve PCR tanımlaması için PCR karışımına az miktarda lizis süpernatant ekleyin.

3.1 Uygulamalar

Hayvan gen amplifikasyonu tespiti, transgenik hayvan genotiplemesi, transgenik bitki tanımlaması, bitki genotiplemesi vb.

3.2 Özellikler

★   Doğrudan: DNA saflaştırması yok;
★   Hızlı: Şablon hazırlama işlemi 10 dakikada tamamlanır, PCR reaksiyonu 50 dakikada tamamlanır;
★   Basit: Numuneler, kesme veya öğütme işlemine gerek kalmadan parçalanabilir;
PCR Karışımı, numune ekleme adımlarını azaltan bir ana karışım biçimindedir
★   Tasarruf: daha az malzeme tüketimi
★   Yüksek verim: lizis reaksiyonu 96-kuyulu plakada tamamlanabilir
★   Güçlü inhibitör toleransı

4. Ürün Verileri

4.1 Çok hayvanlı evrensel tip: Hayvan Dokusu Doğrudan PCR Kiti

4.1.1 En hızlı: çalışma süresini kısaltır

Şekil 2. Yeasen'den alınan hayvan dokusu direkt PCR kiti daha fazla zaman kazandırabilir.

4.1.2 Örnek: Knockout Farelerin Genotip Tanımlaması

Şekil 3. Gen nakavt hayvanların tespiti için hayvan dokusunun doğrudan amplifikasyonu doğrudan PCR kitinin sonuçları.

M: 100bp DNA merdiveni. Hatlar 1-8: şablon olarak lizat. +: Şablon olarak 50 ng Saflaştırılmış genomik DNA. ﹣: Şablon olarak deiyonize su. Birkaç döngü: 35 döngü. Tek parça (580bp): Nakavt hayvan homozigot genomu. Tek parça (180bp): Vahşi tip genomu. İki parça (580bp/180bp): Nakavt hayvan heterozigot genomu.

4.2 Kemirgenlere özgü: Fare Doku Doğrudan PCR Kiti

4.2.1 Daha hızlı: Yeterli gen salınımı

Şekil 4 Farklı lizis sürelerine sahip fare doku direkt PCR kitinin direkt amplifikasyon sonuçları.

M: 100bp DNA merdiveni. +: Şablon olarak 50 ng saflaştırılmış genomik DNA. Birkaç döngü: 35 döngü.

4.2.2 Genel alkali lizis yönteminden daha iyi

Şekil 5. Farklı lizis yöntemleri uygulanan fare kuyruğunun SOX21 gen amplifikasyon sonuçları.

M: 100 bp DNA merdiveni. Hatlar 1-2: Genel alkali lizisle şablon olarak lizat. Hatlar 3-4: Fare doku direkt PCR kitiyle şablon olarak lizat. +: Şablon olarak 50 ng saflaştırılmış genomik DNA. -: Şablon olarak deiyonize su. Birkaç döngü: 35 döngü.

4.2.3 Benzer ürünlerle karşılaştırın

Şekil 6. Farklı markalara ait benzer ürünlerle muamele edilen fare kuyruğunun SOX21 gen amplifikasyon sonuçları.

M: 100 bp DNA merdiveni. +: Şablon olarak 50 ng saflaştırılmış genomik DNA. Birkaç döngü: 35 döngü.

4.3 Bitki Doku Doğrudan PCR Kiti

4.3.1 Çok tipli bitki numunesi doğrulaması

Şekil 7. Farklı bitkilerden elde edilen yaprakların doğrudan çoğaltılmasının sonuçları.

M: 100 bp DNA merdiveni. C: Şablon olarak saflaştırılmış genomik DNA.Şeritler 1-2: Şablon olarak yaprak dokusu lizatı. Birkaç döngü: 30 döngü.

5. Müşteri Geri Bildirimi

5.1 Fare Genotiplemesi

Şekil 8. Beijing Jishi Life Technology Co., Ltd. kullanıcıları tarafından fare doku direkt PCR kiti kullanılarak yapılan fare genotip tanımlamasının sonuçları.

5.2 Pirinç Doğrudan PCR

Şekil 9. Huazhong Tarım Üniversitesi kullanıcıları tarafından bitki dokusu doğrudan PCR kitleri kullanılarak pirinçle ilgili genlerin çoğaltılması.

6. Ürün Sipariş Bilgileri

Yeasen, üç ana biyolojik reaktifin araştırma, geliştirme, üretim ve satışıyla uğraşan bir biyoteknoloji şirketidir: moleküller, proteinler ve hücreler. Yeasen tarafından sağlanan ürünler aşağıdaki gibidir.

Tablo 1. Ürün Sipariş Bilgileri