Kit, örnekleri (örneğin hücreler, fare kuyruğu, fare kulağı, fare parmağı, kas vb.) hızla lize ederek genomik DNA'yı serbest bırakabilen güçlü bir lizis tamponuyla donatılmıştır ve lizat, saflaştırma olmadan doğrudan PCR reaksiyon sistemine eklenebilir, bu da kullanım için uygundur. Ayrıca, bu kit düşük örnek girişi gerektirir, deneyler için 5 mg fare dokusu veya 1-5 mm fare kuyruğu kullanılabilir.

Bileşenler

Depolamak

19697-A (Lizis Çözeltisi) aşağıdaki koşullarda saklanmalıdır: 2~8℃ için 1 Yıllar. Birden fazla kez kullanıldığında, çapraz bulaşmayı önlemek için lütfen ayrı paketlerde dondurun. 19687-B (Çözüm Durdurma) şu şekilde saklanmalıdır: -25~-16℃ için 1 Yıllar.

Talimatlar

Fare Genomik DNA Yayını

1. 1,5 mL santrifüj tüpüne 5-10 mg hayvan dokusu veya 1-5 mm fare kuyruğu kesilir*.
2. Yukarıdaki santrifüj tüpüne 90 μL Tampon ML ekleyin, lizatın numuneye tamamen nüfuz etmesi için hafifçe karıştırın ve kısa bir süre santrifüjleyin.
3. Termostatik inkübatörde 95°C'de 15 dakika inkübe edin**.
4. 10 μL Tampon MT ekleyin, karıştırmak için çırpın ve lizizi sonlandırın.
5. İsteğe bağlı adım: 12000 rpm'de 2 dakika santrifüjleme.
6. Üstteki sıvıyı yeni bir santrifüj tüpüne aktarın ve 4°C veya -20°C'de saklayın veya üstteki sıvıyı doğrudan alarak sonraki PCR amplifikasyonunu gerçekleştirin.

* Lizis reaksiyonunun daha düzgün bir şekilde ilerlemesini sağlamak için doku mümkün olduğunca kesilmelidir.

**95°C'de 15 dakika inkübasyon genellikle çoğu PCR ihtiyacı için yeterlidir. Daha fazla miktarda DNA gerekiyorsa veya numunenin lize edilmesi zorsa, süre 30 dakikaya kadar uzatılabilir. Doku bloğunun tamamen lize edilmesi gerekmez ve kalıntı, sonraki bir santrifüjleme adımında çıkarılabilir.

Hücre Genomu DNA'sının Serbest Bırakılması

Transfekte hücreleri 48 kuyulu bir plakada 3 gün boyunca kültüre ettikten ve yaklaşık 70.000 hücre/kuyu hücre yoğunluğuna ulaştıktan sonra, ortamı mümkün olduğunca tamamen çıkarın. Daha sonra kuyu başına doğrudan 90ul ML tampon ekleyin ve her kuyuyu pipetleyin. Hepsini 96 kuyulu PCR plakasına aktarın. 95 °C'de bir PCR makinesinde 5-15 dakika işlemden geçirdikten ve soğuttuktan sonra, 10ul MT tamponu ekleyin ve eşit ve iyice üfleyin. Yüksek doğrulukta enzim (Kat# 10164) veya Taq enzimi kullanarak, her 50ul PCR reaksiyon sistemine 0,5-2ul hücre lizatı ekleyin ve PCR gerçekleştirin.

Şekil 1. Doğrudan PCR ile 19697 ile muamele edilmiş hücre lizatı.

Notlar

1. Bu ürün yalnızca araştırma amaçlıdır.
2. Lütfen güvenliğiniz için gözlük, laboratuvar önlüğü ve tek kullanımlık eldivenlerle çalışın.
3. Numuneler arasında çapraz bulaşmayı önlemek için, her numune alımından sonra numune alma cihazının kenarının veya numune ile doğrudan temas eden kısmının %2’lik sodyum hipoklorit solüsyonuna daldırılması, birkaç kez yıkanması ve tekrar kullanılmadan önce kalan sıvının temiz bir kağıt havluyla kurulanması gerekmektedir.Testin kolaylığı için, her bir numunenin kontaminasyondan arındırılmış bir numune alma cihazı ile numune alınmasını garantilemek amacıyla, birden fazla numune alma cihazı hazırlanabilir ve kullanımdan sonra eşit şekilde temizlenebilir.
4. Taze alınmış hayvan dokularının kullanılması önerilir. Uzun süreli dondurulmuş dokular söz konusu olduğunda, mümkün olduğunca tekrarlanan dondurma ve çözme işlemlerinden kaçınılmalıdır, aksi takdirde şablonun bozulmasına yol açacak ve PCR etkinliğini etkileyecektir.

Belgeler:

Kılavuzlar