Yeasen'den Çığır Açan Başarı ve Molefuture biyoteknolojisi

Biyoteknolojinin hızla gelişmesiyle birlikte, yeni bir tedavi yöntemi olarak mRNA terapisi, güçlü programlanabilirliği ve hızlı yanıt hızı nedeniyle büyük ilgi görmüştür. mRNA aşıları ve gen terapisi gibi alanlarda, yüksek kaliteli mRNA'nın verimli bir şekilde sentezlenmesi, terapötik hedeflere ulaşmada önemli bir adımdır. Bu süreçte, T7 RNA polimerazı, mRNA'nın in vitro sentezini verimli bir şekilde katalize edebildiği için önemli bir rol oynar.

T7 RNA polimerazının dsRNA yan ürünü sorunu

T7 RNA polimerazı mRNA sentezinde önemli bir rol oynamasına rağmen, gerçek operasyon genellikle yan ürün olarak çift sarmallı RNA (dsRNA) üretimiyle sonuçlanır. dsRNA'nın varlığı yalnızca mRNA verimini ve saflığını azaltmakla kalmaz, aynı zamanda etkinliği ve güvenliği etkileyen spesifik olmayan bağışıklık tepkilerini de tetikleyebilir. Bu nedenle, dsRNA üretiminin azaltılması sektörde acil bir ihtiyaç haline gelmiştir. Günümüzde, dsRNA'yı azaltma yöntemleri çoğunlukla reaksiyon koşullarını optimize etmeyi ve yardımcı enzimleri kullanmayı içerir. Bu yöntemler dsRNA üretimini bir dereceye kadar azaltabilse de, genellikle karmaşık operasyon ve artan maliyetler gibi sorunlarla birlikte gelirler.

Neden T7 RNA polimeraz mühendisliği yapmalıyız?

T7 RNA polimerazını doğrudan değiştirerek dsRNA üretimini azaltmak daha temel bir çözümdür. Enzim yönlendirmeli evrim teknikleri, enzimin amino asit dizisini veya yapısını hassas bir şekilde değiştirerek katalitik özelliklerini iyileştirebilir ve ürünlerin saflığını ve verimini artırabilir. T7 RNA polimerazı için hedefli modifikasyon yalnızca dsRNA üretimini azaltmakla kalmaz, aynı zamanda mRNA sentezinin genel verimliliğini ve kalitesini de artırabilir.

mRNA in vitro sentez hammaddelerinin tedarikçisi olarak Yeasen Biyoteknoloji ve iştiraki Molefuture Biyoteknoloji, sahip olmak ZymeEditor yönlendirilmiş evrim platformunu kullanarak yeni bir T7 RNA polimerazı geliştirdi. İn vitro transkripsiyon süreçleri sırasında dsRNA gibi yan ürünlerin üretimini en aza indirmek için evrim ekibi, rasyonel tasarım ve yönlendirilmiş taramanın bir kombinasyonu yoluyla T7 RNA polimerazını tasarladı.

dsRNA nasıl oluşur?

Literatür raporlarına göre, yan ürün dsRNA'nın üretimi esas olarak iki kaynaktan kaynaklanır (Şekil 1): Birincisi, T7 RNA polimerazının transkripsiyonun erken aşamalarında başlatma konformasyonundan uzama konformasyonuna geçişi sırasında, transkripsiyon üçlü kompleksi ayrışmaya eğilimlidir [1], bunun sonucunda sisteme yaklaşık 20 nt uzunluğunda çok sayıda kısa RNA zinciri (Abortif RNA) salınır. Bu RNA zincirleri, uzun RNA zincirleriyle tamamlayıcı eşleşme yapan "primerler" olarak işlev görür ve T7 RNA polimerazının RNA'ya bağımlı RNA polimeraz aktivitesinin (RDRP aktivitesi) etkisi altında dsRNA üretmek üzere uzanır [2,3]. İkinci kaynak, T7 RNA polimerazının sahip olduğu terminal ribonükleotid transfer aktivitesi tarafından tetiklenir. Transkripsiyon reaksiyonu doğrusal şablonun sonuna ulaştığında, T7 RNA polimerazı şablon bağımlılığı olmadan rastgele birkaç ribonükleotid ekleyebilir. "Rastgele primerler" oluşturan bu ribonükleotidler, ters katlanabilir ve hedef mRNA bölgesiyle tamamlayıcı bir şekilde eşleşerek dsRNA üretmek üzere genişleyebilir. Döngü yoluyla üretilen dsRNA'ya döngü geri dsRNA denir [3,4]. Bu nedenle, dsRNA yan ürünlerini azaltmak için T7 RNA polimeraz modifikasyonunun odak noktası, erken transkripsiyon üçlü kompleksini stabilize etmek veya terminal transfer aktivitesini ve RNA bağımlı RNA Polimerazı (RDRP) zayıflatmaktır T7 RNA polimeraz aktivitesi.

Şekil 1. Enerji bariyeri ve dsRNA oluşum prensibinin şematik diyagramı (yayınlanmamış veri)

Nasıl üstesinden gelinir enerji bariyeri T7 RNA polimerazının konformasyonel geçiş?

Yapısal ve serbest enerji analizi yoluyla ekip, bir yandan T7 RNA polimerazının konformasyonel değişimleriyle birlikte enerjide de bir değişim olduğunu keşfetti. Uzatma konformasyonunun serbest enerjisi, başlatma konformasyonundan önemli ölçüde daha yüksektir ve bu da transkripsiyon sürecinin tam mRNA zincirleri üretmek için daha yüksek bir enerji bariyerini aşması gerektiğini gösterir. Yüksek bir enerji bariyeri, düzgün konformasyonel geçiş için elverişsizdir. Bu nedenle ekip, akılcı 20'den fazla sıcak nokta amino asidini belirlemek için tarama yöntemleri kullanıldı ve karşılık gelen doygunluk mutagenezi kütüphaneleri oluşturuldu.

Nasıl değiştirilir? T7 RNA polimerazının terminal transferi ve RDRP aktiviteleri

Öte yandan, T7 RNA polimerazının terminal transferi ve RDRP aktiviteleri ile ilgili işlevler, yerler ve yapısal alanlar hakkındaki sınırlı raporlar ve işlevsel olarak benzer olan bu iki aktivitenin, T7 RNA polimerazının ana reaksiyonu olan transkripsiyon aktivitesi (yani, DNA'ya bağlı RNA polimerizasyon aktivitesi, DDRP) ile önemli yerleri paylaşması nedeniyle, yer yönlendirmeli modifikasyon için sıcak nokta amino asitleri bulmak zordur. Bu nedenle, ekip aynı anda, ZymeEditor platformunun yüksek verimli evrim kapasitesiyle birleştirilmiş, hataya açık PCR'ye dayalı birkaç rastgele mutasyon kütüphanesi oluşturdu ve her bir kütüphane için 10^6'yı aşan bir çeşitlilik elde etti.

İdeal keşfin araştırma tabanlı keşfi T7 RNA polimeraz

T7 RNA polimeraz üretimini dengelemek ve in vitro transkripsiyon reaksiyonunda dsRNA içeriğini izlemek için ekip, optimize edilmiş transkripsiyon şablonlarına atıfta bulunarak, dikkatlice birden fazla Floresan tasarladı hedef mRNA ürünlerinin farklı bölgelerini hedefleyen problar. Bu problar, reaksiyon verimi, bütünlük ve sistem içindeki dsRNA içeriği gibi bilgileri floresan sinyalleriyle ilişkilendirir. Sistemin floresan yoğunluğu ne kadar güçlüyse, mutantın performansı o kadar avantajlıdır. Teoride, bu tarama yöntemi mutantları farklı probların floresan yoğunluğuna göre sıralayabilir, yüksek verimli veya azaltılmış Abortif RNA'lı T7 RNA polimeraz mutantlarının yanı sıra iyileştirilmiş bütünlüğe veya azaltılmış geri döngü dsRNA'sına sahip mutantlar elde edebilir. Reaksiyon şablonu RNA ile değiştirildiğinde, azaltılmış RDRP aktivitesine sahip mutantlar da negatif olarak taranabilir ve T7 RNA polimerazının şablon seçiciliği iyileştirilebilir. Ek olarak, modifiye nükleotidler, kap analogları ekleyerek ve damlacık reaksiyon sistemindeki reaksiyon sıcaklığını artırarak, doğal olmayan substratlara tolerans gösteren ve iyileştirilmiş termal stabilite gösteren T7 RNA polimeraz mutantlarını seçmek için daha fazla tarama yapılabilir.

En iyi tarama nasıl yapılır T7 RNA polimeraz?

Kütüphanelerin büyüklüğüne göre ekip floresanla aktive edilen damlacık ayırma (FADS) temelli ultra yüksek verimli tarama prosesleri ve geleneksel mikro plaka yöntemlerine (MTPS) dayalı yüksek verimli tarama prosesleri geliştirildi.Birden fazla deney turu boyunca, toplamda 10^7'den fazla mutant tarandı ve önemli ölçüde azalmış dsRNA içeriğine sahip birden fazla mutant elde edildi. Bunlar arasında, bazı mutantlar reaksiyonda Abortif RNA'nın neden olduğu dsRNA'da bir azalma gösterdi ve bu, bu polimeraz mutantlarının uzama konformasyonunun daha kararlı olduğunu düşündürdü. Bazı mutantlar reaksiyonda loopback dsRNA içeriğinde bir azalma gösterdi ve bu mutantlarda terminal transfer aktivitesinin veya RDRP aktivitesinin zayıfladığını gösterdi.

Yukarıda belirtilen mutantların performans avantajlarının farklı mekanizmalardan kaynaklandığı göz önüne alındığında, ekip hedeflenen DNA karıştırma kütüphaneleri oluşturdu. Taramadan sonra, ekip sonunda üstün performanslı mutantlar elde edildi aşırı düşük dsRNA üretimiyle, verimi ve mRNA bütünlüğünü etkilemeden (Şekil 2). Ancak, Moderna tarafından keşfedilen bir mutant G47A+884G'nin verimi etkilendi^[5] (yayınlanmamış).

Şekil 2. Enzim evrim süreci ve mutant performansının karakterizasyonu

(yayınlanmamış)

dsRNA üretiminin analizi T7 RNA polimeraz çeşitleri?

Şekil 3'te gösterildiği gibi, eş-transkripsiyon kapatma koşulları altında 9 kb'lik bir transkripsiyon şablonu kullanılarak yapılan kantitatif analizden sonra, doğal nükleotidler kullanıldığında vahşi tip T7 RNA polimerazı yaklaşık 2,9 ng/μg dsRNA üretirken, ticari bir T7 enzimi yaklaşık 0,18 ng/μg dsRNA üretti. Ancak, her T7 RNA polimeraz varyantının dsRNA üretimi inşa edilen 0,10 ng/μg'dan azdı. Özellikle, bir varyant sadece 0,015 ng/μg idi, bu vahşi tipten yaklaşık 200 kat ve ticari tipten 12 kat daha düşüktü Ürün. Tekrarlanan testlerden sonra, varyantların dsRNA'yı azaltmadaki performans avantajı, farklı reaksiyon koşulları altında tutarlı bir şekilde gözlemlendi; bu, bu mutantların iyi sistem uyumluluğunu gösteriyor ve reaksiyon tamponu aracılığıyla dsRNA üretimini daha da azaltmak için bir temel oluşturuyor optimizasyon. Ayrıca, FADS taraması, daha geniş bir in vitro transkripsiyon uygulamaları yelpazesinin gereksinimlerini karşılayabilen, iyileştirilmiş ürün bütünlüğü ve termal kararlılığa sahip birden fazla varyant elde etti.

Şekil 3. Yeasen Çift Zincirli RNA (dsRNA) ELISA Kiti ve J2 antikor nokta blot analizi kullanılarak değerlendirilen T7 RNA polimeraz varyantları tarafından dsRNA üretiminin değerlendirilmesi.

Şu anda birkaç ortağımız T7 RNA polimeraz varyantlarını denedi ve onlardan büyük övgü aldık. Yeni enzimin kullanımı mRNA saflaştırma sürecini basitleştiriyor, iş verimliliğini artırıyor ve çoklu uygulama senaryolarında olağanüstü performans gösteriyor.

Bu varyantlar patent başvurusu aşamasında olup, teknoloji işbirliği ve lisanslama konusunda görüşmeleri memnuniyetle karşılıyoruz.

Molefuture Biyoteknoloji Hakkında

Molefuture Biotechnology, Yeasen'in bir yan kuruluşudur Enzim evrim teknolojisiyle yönlendirilen özelleştirilmiş enzim modifikasyon çözümleri sağlama konusunda uzmanlaşmış Biotechnology (Shanghai) Co., Ltd.Yeasen kaynaklarından yararlanma Biyoteknoloji, Molefuture altı büyük teknolojik platformda faaliyet göstermektedir: ZymeEditor yenilikçi enzim evrim platformu, çok konaklı yüksek verimli ifade platformu, fermantasyon süreci geliştirme platformu, saflaştırma süreci geliştirme platformu, ultra temiz enzim üretim platformu ve enzim analizi ve kalite kontrol platformu. Bu altı teknolojik platformla Molefuture, enzim yönlendirmeli evrim, yeni enzim geliştirme, enzim süreci geliştirme ve in vitro tanı, biyomedikal, sentetik biyoloji, tıbbi estetik, farmasötik ara ürünler vb. alanlardaki enzimlerin uygulama taleplerini karşılamak için GMP düzeyinde ölçeklendirme üretimi dahil olmak üzere eksiksiz bir özelleştirilmiş çözüm seti sunabilir.

Sipariş Bilgileri

Aşağıdakiler Yeasen tarafından sunulan temsili ürünlerdir. Ek boyutlar mevcuttur. Ürünlerimiz, üstün performans ve yeniden üretilebilirliği garanti altına almak için uyumlu bir şekilde çalışmak üzere son derece optimize edilmiştir. Ayrıca özelleştirilmiş hizmetler de sağlayabiliriz. Gösterilmeyen bir ürünle ilgileniyorsanız, bizimle iletişime geçin ve ihtiyaçlarınızı karşılamak için sizinle birlikte çalışalım.

Okuma ile ilgili olarak:

dsRNA Tespitinin Standardizasyonunu Teşvik Etmek İçin Çift Zincirli RNA (dsRNA) ELISA Kitinin Doğrulama Raporunun Paylaşılması.

Referanslar:

[1] Sousa R, Mukherjee S. T7 RNA polimerazı[J]. Nükleik asit araştırmaları ve moleküler biyolojideki ilerlemeler, 2003: 1-41.

[2] Steitz T A. T7 RNA polimerazının transkripsiyon başlangıcından uzamaya kadar yapısal değişimleri[J]. Yapısal biyolojide güncel görüş, 2009, 19(6): 683-690.

[3] Vallejo D, Nikoomanzar A, Paegel BM, ve diğerleri. Tek hücreli yönlendirilmiş evrim için floresanla aktive edilen damlacık ayırma[J]. ACS sentetik biyoloji, 2019, 8(6): 1430-1440.

[4] Gholamalipour Y, Karunanayake Mudiyanselage A, Martin C T. T7 RNA polimerazı tarafından yapılan 3′ uç eklemeleri RNA'nın kendi kendine şablonunu oluşturur, dağıtıcıdır ve karakter olarak çeşitlidir—RNA-Seq analizleri[J]. Nükleik asitler araştırması, 2018, 46(18): 9253-9263.

[5] Dousis A, Ravichandran K, Hobert EM, ve diğerleri. İmmunostimülan yan ürünlerden arındırılmış mRNA üreten tasarlanmış bir T7 RNA polimerazı[J]. Nature Biotechnology, 2023, 41(4): 560-568.