mRNA in vitro transkripsiyonu sırasında kalıntı dsRNA'yı tespit etmenin güvenilir bir yolunu mu arıyorsunuz? Double-stranded RNA (dsRNA) ELISA Kit'ten başkasına bakmayın. Ancak, piyasada bulunan birkaç kit ile doğrulama verilerinin her zaman herkese açık olmayabileceğini ve bu durumun dsRNA tespitinde tutarsızlığa yol açabileceğini unutmamak önemlidir. Bu nedenle, özgüllük, hassasiyet, doğruluk, duyarlılık ve dayanıklılığı kapsayan Double-stranded RNA (dsRNA) ELISA Kit doğrulama raporumuzu paylaşıyoruz. Bu rapor, belirli deneysel koşullara ve düzenleyici farmakope standartlarına göre uyarlanmış dsRNA kalıntı tespit yöntemlerini doğrulamak için bir referans kılavuzu görevi görür. Lütfen doğrulama raporumuz hakkında daha fazla bilgi edinin dsRNA tespitinin standardizasyonunu teşvik etmek.
Çift sarmallı RNA (dsRNA) ELISA KBT
Arka plan:
Çift sarmallı RNA (dsRNA) ELISA Kiti, mRNA in vitro transkripsiyon süreci sırasında üretilen kalıntı dsRNA'yı tespit etmek için tasarlanmış bir reaktif kitidir. Çift antikor sandviç enzim bağlı immünosorbent testi (ELISA) ve biyotin-streptavidin amplifikasyon sisteminin deneysel prensibini kullanan bu kit, örneklerdeki kalıntı dsRNA'nın hassas bir şekilde tespit edilmesini sağlar.
Özet veriler, özgüllük, kesinlik, doğruluk, duyarlılık ve dayanıklılığı kapsayan doğrulama parametrelerini içerir. Rapor, kullanıcıları kendi özel deneysel koşullarına göre uyarlanmış ve düzenleyici farmakope standartlarına bağlı kalarak dsRNA kalıntı tespit yöntemlerini doğrulamaya teşvik eden bir referans kılavuzu görevi görür.
Materyal ve Yöntemler:
Kit: Çift sarmallı RNA (dsRNA) ELISA Kiti: Cat#36717ES (YEASEN)Kit, dört farklı dsRNA standart örneği türü içerir. Kullanıcılar, standart eğriyi oluşturmak için kendi özel süreçleriyle uyumlu standart örnek türünü seçme seçeneğine sahiptir, böylece tüm örnekleri hazırlama ve test etme zorunluluğundan kaçınılır.
Yöntemler: Deney için gerekli olan malzemeler ve prosedür adımları ağırlıklı olarak Yeasen Biotechnology tarafından belirtilmiştir. Kit, performansının ICH Q2(R1) ve Çin Farmakopesi Bölüm Dört "9101 Analitik Yöntem Doğrulama Kılavuzları"nın 2020 baskısının şart koşulan gereksinimlerini karşıladığından emin olmak için kapsamlı test ve değerlendirmelerden geçmiştir.
Sonuçlar
- dsRNA Standartlarının Doğrusallığı
Bu rapor, her biri 300 bp uzunluğunda olan dört farklı dsRNA standardı türü için standart eğriler geliştirmiştir. Bu standartlar arasında, değiştirilmemiş dsRNA STD1; Pseudo-UTP değiştirilmiş dsRNA STD2; 5-OMe-UTP değiştirilmiş dsRNA STD3; N1-Me-Pseudo-UTP değiştirilmiş dsRNA STD4 yer almaktadır. Her dsRNA standardı türü, Tablo 1 ila Tablo 5'te gösterilen R2 > 0,99 ve ölçülen konsantrasyonun varyasyon katsayısı (CV) %10'dan az olan mükemmel seyreltme doğrusallığı sergiler.
| STD Adı | UTP Türü | Seyreltmenin doğrusallığı (R2＞0,99) | Özgeçmiş |
| SINIF 1 | UTP | 0.0156-1 pg/ μL | ＜%10 |
| STD2 | pUTP | 0,0156-1 pg/μL | ＜%10 |
| STD3 | N1-Me-pUTP | 0,0312-1 pg/μL | ＜%10 |
| STD4 | 5-OMe-UTP | 0,0625-1 pg/μL | ＜%10 |
Tablo 1. Farklı dsRNA standartlarının doğrusallığı.
| STD1 konsantrasyonuN. (pg/μL) | Ölçülen ortalama (pg/μL) | İyileşmek | Özgeçmiş |
| 1 | 1.0001 | 100.0% | %3,1 |
| 0,5 | 0,4994 | %99,9 | %2,4 |
| 0,25 | 0,2516 | 100.7% | %3,3 |
| 0,125 | 0,1227 | %98,1 | %0,5 |
| 0,0625 | 0,0640 | %102,5 | %3,2 |
| 0,0312 | 0,0309 | %99,2 | %1,3 |
| 0,0156 | 0,0157 | 100.4% | %3,2 |
| 0 | / | / | / |
Tablo 2.Kurtarma ve CV seyreltilmiş STD1'in
| STD2 konsantrasyonuN. (pg/μL) | Ölçülen ortalama (pg/μL) | İyileşmek | Özgeçmiş |
| 1 | 1.0001 | 100.0% | 0,7% |
| 0,5 | 0,4994 | %99,9 | 0,1% |
| 0,25 | 0,2514 | %100,6 | 0,9% |
| 0,125 | 0,1232 | %98,6 | %2,5 |
| 0,0625 | 0,0635 | 101.6% | %1,1 |
| 0,0312 | 0,0312 | %99,9 | %0,5 |
| 0,0156 | 0,0155 | %99,6 | 0,0% |
| 0 | / | / | / |
Tablo 3. Kurtarma ve CV seyreltilmiş STD2'nin
| STD3 konsantrasyonu (pg/μL) | Ölçülen ortalama (pg/μL) | İyileşmek | Özgeçmiş |
| 2 | 2.0031 | %100,2 | 1.%6 |
| 1 | 0,9880 | %98,8 | %2,4 |
| 0,5 | 0,5188 | 103.8% | %1,2 |
| 0,25 | 0,2383 | %95,3 | %2,2 |
| 0,125 | 0,1242 | %99,4 | 0,1% |
| 0,0625 | 0,0629 | 100.7% | %1,8 |
| 0,0312 | 0,0361 | 115,7% | %1,6 |
| 0 | / | / | / |
Tablo 4. Kurtarma ve CV seyreltilmiş STD3'ün
| STD4 konsantrasyonu (pg/μL) | Ölçülen ortalama (pg/μL) | İyileşmek | Özgeçmiş |
| 4 | 4.0096 | %100,2 | %1,9 |
| 2 | 1.9940 | %99,7 | 0,7% |
| 1 | 0,9977 | %99,8 | 0,1% |
| 0,5 | 0,5108 | 102.%2 | 0,1% |
| 0,25 | 0,2454 | %98,2 | %5,6 |
| 0,125 | 0,1207 | %96,5 | %2,8 |
| 0,0625 | 0,0624 | %99,9 | %0,3 |
| 0 | / | / | / |
Tablo 5. Kurtarma ve CV seyreltilmiş STD4'ün
-
Özgüllük
- dsRNA, ssRNA, dsDNA ve ssDNA ile özgüllük analizi.
- Özgüllük, dsRNA'ların uzunluğundan etkilenmedi.
-
Adoğruluk
0,5 pg/μL STD1 eklenmesi 0,36 pg/μL dsRNA içeriğine sahip bilinen bir mRNA örneğine üç farklı hacim oranında (1:1, 1:20, 1:250) uygulandı. Tüm durumlarda, spike kurtarma oranları %80-120 aralığındaydı.
Spike kurtarma oranı şu şekilde hesaplanır: Spike İyileşmek Oran=(Ölçülen konsantrasyon sonrasında sivrilen×Toplam hacim ile ilgili dikenli örnek-Ölçülen konsantrasyon ile ilgili , örnek×Toplam hacim ile ilgili , örnek)/(Teorik konsantrasyon ile ilgili , spike×Hacim ile ilgili , sivri)×100%
| Örnekler | STD1/Numune Hacim Oranı | Ölçülen dsRNA (pg/μL) | Diken İyileşmek Oran |
| Örnek (TS) | / | 0,36 | / |
| TS+0,5pg/μL SINIF 1 | 1：1 | 0,769 | %81 |
| TS+0,5pg/μL SINIF 1 | 1:20 | 0,777 | %82 |
| TS+0,5pg/μL SINIF 1 | 1：250 | 0.803 | %82 |
Tablo 6. Spike kurtarma oranı analiz
-
Kesinlik
- Analiz içi hassasiyet
Dört dsRNA standart örneğinin her biri için üç konsantrasyon seviyesinde (yüksek, orta ve düşük) deneyler yürütüldü. Tek bir deneyde, her konsantrasyon örneği sekiz tekrarlı teste tabi tutuldu. Sonuçlar, varyasyon katsayısının (CV) %15'in altında olduğunu gösteriyor iyi bir analiz içi hassasiyete işaret ediyor.
| SINIF 1 | |||
| Teorik Konsantrasyon (pg/μL) | Kopyalar | Ölçülen ortalama (pg/μL) | Özgeçmiş |
| 1 | 8 | 1.0002 | 3.11% |
| 0,125 | 8 | 0,1230 | 0,46% |
| 0,0156 | 8 | 0,0164 | 3.18% |
| STD2 | |||
| Teorik Konsantrasyon (pg/μL) | Kopyalar | Ölçülen ortalama (pg/μL) | Özgeçmiş |
| 1 | 8 | 1.0001 | 0,65% |
| 0,125 | 8 | 0,1231 | 2.46% |
| 0,0156 | 8 | 0,0162 | 0,02% |
| STD3 | |||
| Teorik Konsantrasyon (pg/μL) | Kopyalar | Ölçülen ortalama (pg/μL) | Özgeçmiş |
| 2 | 8 | 2.0022 | 1.58% |
| 0,25 | 8 | 0,2444 | %2,17 |
| 0,0312 | 8 | 0,0328 | 1.64% |
| STD4 | |||
| Teorik Konsantrasyon (pg/μL) | Kopyalar | Ölçülen ortalama (pg/μL) | Özgeçmiş |
| 8 | 8 | 8.0803 | 0,27% |
| 1 | 8 | 0,9650 | 0,12% |
| 0,125 | 8 | 0,1322 | 2.%76 |
Tablo 7. Analiz içi hassasiyet analizi
- Denemeler arası hassasiyet
3'ten kitler kullanılarak üç deney gerçekleştirildi gruplar. Her deneyde, yüksek, orta ve düşük konsantrasyonlar seçildi ve dört dsRNA standart örneğinin her biri için sekiz tekrarla üç kez test edildi. Sonuç olarak, her birinde 24 veri noktası elde edildi Daha sonra varyasyon katsayısı (CV) analizi için kullanılan konsantrasyon seviyesi. Sonuçlar, standartların her konsantrasyonu için CV'nin %15'in altında olduğunu göstermektedir.
| SINIF 1 | |||
| Teorik Konsantrasyon (pg/μL) | Bağımsız Testler/Tekrarlar | Ölçülen ortalama (pg/μL) | Özgeçmiş |
| 1 | 3/8 | 1.0007 | 2.38% |
| 0,125 | 3/8 | 0,1186 | 3.20% |
| 0,0156 | 3/8 | 0,0173 | %1,27 |
| STD2 | |||
| Teorik Konsantrasyon (pg/μL) | Bağımsız Testler/Tekrarlar | Ölçülen ortalama (pg/μL) | Özgeçmiş |
| 1 | 3/8 | 0,9987 | 0,09% |
| 0,125 | 3/8 | 0,1269 | 1.06% |
| 0,0156 | 3/8 | 0,0151 | 0,52% |
| STD3 | |||
| Teorik Konsantrasyon (pg/μL) | Bağımsız Testler/Tekrarlar | Ölçülen ortalama (pg/μL) | Özgeçmiş |
| 2 | 3/8 | 2.0012 | 2.37% |
| 0,25 | 3/8 | 0,2415 | 0,14% |
| 0,0312 | 3/8 | 0,0330 | 1.81% |
| STD4 | |||
| Teorik Konsantrasyon (pg/μL) | Bağımsız Testler/Tekrarlar | Ölçülen ortalama (pg/μL) | Özgeçmiş |
| 8 | 3/8 | 7.9735 | 1.89% |
| 1 | 3/8 | 1.0225 | 0,13% |
| 0,125 | 3/8 | 0.1227 | 5.63% |
Tablo 8. Deneyler arası hassasiyet analizi
-
Hassasiyet
- LOD
Algılama limiti kit Boş değerlerin ortalamasına standart sapmanın iki katı eklenerek belirlenir. 24 boşluğun OD'sini ölçerek, ortalamalarını ve standart sapmalarını hesaplayarak ve sonra bu değerleri uydurulmuş eğriye uygulayarak, karşılık gelen tespit limiti elde edilir.
|
| Aşırı doz |
| ||
| dsRNA Standart | Boşluğun Ortalaması | SD Boş | Boşluğun Ortalaması+2SD | LOD |
| SINIF 1 | 0,016 | 0,00048 | 0,01696 | ≤0,001pg/μL |
| STD2 | 0,016 | 0,00072 | 0,01744 | ≤0,001pg/μL |
| STD3 | 0,034 | 0,00119 | 0,03638 | ≤0,001pg/μL |
| STD4 | 0,115 | 0,00290 | 0,1208 | ≤0,01pg/μL |
Tablo 9. LOD analizi
- Nokta
Nicel sınırı kit Standart eğrinin en düşük konsantrasyon noktasının daha da düşük seviyelere seyreltilmesiyle, en düşük konsantrasyonda CV < %20 sağlanarak, kantitatif eşik değeri tanımlanır. LOQ aşağıdaki gibidir.
| dsRNA Standart | Nokta | Kopyalar | ÖZGEÇMİŞ(%) | İyileşmek (%) |
| SINIF 1 | 0,0156 pg/μL | 24 | <10% | %80~120 |
| STD2 | 0,0312 pg/μL | 24 | <10% | %80~120 |
| STD3 | 0,0156 pg/μL | 24 | <10% | %80~120 |
| STD4 | 0,125 pg/μL | 24 | <10% | %80~120 |
-
Ddayanıklılık
- IVT malzemelerinde anti-parazit
Bu test çeşitli enzimlerin, tamponların vb. etkisini değerlendirmeyi amaçlamıştır. mRNA kit ile dsRNA tespiti üzerine örnek.
Sağlanan mRNA örneğine belirli konsantrasyonlarda T7 RNA polimeraz, RNAse İnhibitörü, IPPA (inorganik pirofosfataz), DNase I, VCE (vaccinia kaplama enzimi), 2'-O-Metiltransferaz (MT), 1×IVT tamponu ve 1mM sodyum sitrat eklenmesi ve ardından STD3'ün kullanılması Hem standart eğri hazırlama hem de örnek testi için, kitin bu örneklerdeki dsRNA içeriğini tespit etme yeteneğinin değerlendirilmesini sağladı örnekler. Sonuçlar, sekiz farklı enzim ve tamponun varlığının dsRNA'nın doğru tespitini etkilemediğini göstermektedir. Ek olarak, gözlemlenen geri kazanım oranları %80 ila %120 aralığında düşmüştür.
| IVT Malzemeleri | dsRNA Ölçülen (pg/μL) | İyileşmek |
| Hiçbiri | 0,6057 | %100 |
| T7 RNA Polimeraz (15μg/mL) | 0,5411 | 89.32% |
| Fare RNaz İnhibitörü (27,5 μg/mL) | 0,5142 | 84.88% |
| İnorganik Pirofosfataz (IPPA 10μg/mL) | 0,7132 | 117,7% |
| DNase I (13,75 μg/mL) | 0,6077 | 100.32% |
| Vaccinia Kapama Enzimi (10μg/mL) | 0,6563 | 108.3% |
| 2´-O-Metiltransferaz (10μg/mL) | 0,5776 | %95,4 |
| 1×IVT tamponu | 0,5003 | %82,6 |
| 1mM Sodyum sitrat | 0,6251 | 103.2% |
Tablo 11. IVT malzemeleriyle eklenen seyreltilmiş STD3'ün geri kazanımı
- Sıcaklık ddayanıklılık
Kitler her ikisinde de saklandı 4°C ve 37°C dsRNA standardının konsantrasyon varyanslarını 7 gün sonra tespit etmek için. Sonuçlar varyansların hepsinin %20 içinde olduğunu göstermektedir.
| dsRNA Standart | dsRNA Ölçülen (pg/μL) Gün 0 | Varyanslar 4°C'de 7 gün sonra |
| SINIF 1 | 1 | %10 |
| STD2 | 1 | %5 |
| STD3 | 2 | %7 |
| STD4 | 4 | %11 |
| dsRNA Standart | dsRNA Ölçülen (pg/μL) | Varyanslar 37°C'de 7 gün sonra |
| SINIF 1 | 1 | %18 |
| STD2 | 1 | %4 |
| STD3 | 2 | %5 |
| STD4 | 4 | %8 |
Tablo 12. Sıcaklık dayanıklılık analizi
İlgili Ürün:
| Ürün adı | Stok Kodu | Özellikler |
| Çift sarmallı RNA (dsRNA) ELISA kiti | 36717ES | 48T/96T |
| CleaScrip™ T7 RNA Polimeraz (düşük ds RNA, 250 U/μL) | 10628ES | 10/100 KU |
| T7 RNA Polimeraz GMP sınıfı (250 U/μL) | 10625ES | 10/100 KU |
İlgili Okumalar:
Düşük dsRNA T7 RNA polimeraz mutantlarını doğrulamak için Çift Zincirli RNA (dsRNA) ELISA Kiti, J2 antikor nokta blotting yöntemi ile birlikte kullanıldı.
Düşük dsRNA T7 RNA Polimeraz Mutantları, mRNA Aşısı ve Terapi Geliştirmeyi Güçlendiriyor
Referanslar:
- ICH, 2022: Analitik Yöntem Doğrulaması Q2, taslak versiyon.
- NMPA, 2007: Biyolojik Ürün Kalite Kontrol Analizi için Analitik Yöntem Doğrulamasının Değerlendirilmesine İlişkin Genel İlkeler
- Çin Farmakopesi Komisyonu (ChPC), 2020: Çin Farmakopesi, Dördüncü Bölüm: Biyolojik Örnekler İçin Kantitatif Analiz Yöntemlerinin Doğrulanmasına Yönelik Kılavuzlar