Son yıllarda mRNA tabanlı ilaçlar önemli ilgi görmüş ve araştırma odağı haline gelmiştir. T7 RNAP, basitliği ve yüksek verimle RNA sentezini katalize etme yeteneği ile bilinir ve in vitro sadakat. Ancak, transkripsiyon süreci sırasında T7 RNAP, abortif kısa RNA'lar, erken sonlandırılmış RNA'lar ve 3'-uzatılmış RNA'lar gibi yan ürünler üretebilir ve bu da dsRNA oluşumu için elverişli koşullar yaratır. Bu nedenle, dsRNA üretiminin azaltılması pratik uygulamalarda acil bir ihtiyaç haline gelmiştir.
Son zamanlarda " başlıklı çığır açıcı bir çalışmaFADS ve yarı rasyonel tasarım modifiye edilmiş T7 RNA polimerazı, daha düşük terminal transferaz ve RDRP aktiviteleri ile dsRNA üretimini azalttı"Yeasen ve Molefuture Ekibi tarafından çevrimiçi olarak yayınlandı. Araştırmacılar, yönlendirilmiş evrim ve yarı rasyonel tasarımın bir kombinasyonu yoluyla, transkripsiyon sırasında dsRNA yan ürünlerinin üretimini önemli ölçüde azaltmak için T7 RNAP'ı başarıyla tasarladılar ve bunu vahşi tip enzimin %1,8'ine düşürdüler.
T7 RNAP'ın FADS tabanlı taraması
T7 RNAP'yi taramak için, protein evriminin yüksek verimli gereksinimlerini karşılamak üzere FADS (Floresansla aktive edilen damlacık ayırma) seçildi. Hücrelerin erken parçalanmasını önlemek için, Araştırmacılar, lizozimin çip üzerindeki hücrelerle karıştırıldığı ve damlacıklar içinde aktivitesini uyguladığı çift sulu fazlı bir PDMS çipi kullandılar Şekil 1Araştırmacılar, 10'dan başlayan çeşitliliğe sahip birkaç rastgele mutant kütüphanesi oluşturdular.5 10'a kadar6Tarama sonucunda 10 baskın varyant belirlendi ve Mut1'den Mut10'a kadar isimlendirildi. Gösterildiği gibi Şekil 2E Ve Şekil 2FMut1, Mut7 ve Mut9'un dsRNA içeriği, vahşi tiptekinden önemli ölçüde daha düşüktü
Şekil 1. FADS'a Genel Bakış
Şekil 2. Rastgele kütüphane taraması ve varyant değerlendirmesi
T7 RNAP'ın yarı rasyonel tasarımı
Araştırmacılar yarı rasyonel bir tasarım araştırması yürütüldü, on adet tek siteli doymuş kütüphane oluşturuldu ve tarama için geleneksel mikrotitre plakası tabanlı çift prob yöntemi kullanıldıŞekil 3). Eklenen 5'-uç probu RNA veriminin tespiti için kullanılır.
Şekil 3. Azalmış dsRNA için yapı-yönlendirmeli yarı-rasyonel tasarım
1000'den fazla mutantı taradıktan sonra, Araştırmacılar altı aday belirlendi: Mut11 (K180E), Mut12 (S228F), Mut13 (G238L), Mut14 (A70Q), Mut15 (A383H) ve Mut16 (I743L). Altı mutantın toplam RNA verimi, vahşi tipten önemli ölçüde farklı değildi ve bu da karşılaştırılabilir genel transkripsiyon verimliliğini gösteriyordu. Beklendiği gibi, Mut11 ve Mut14'ün dsRNA içeriği, vahşi tipe kıyasla önemli ölçüde düşüktü(Şekil 4).
Şekil 4. Mikrotitre plaka taraması ve varyant değerlendirmesi
DNA karıştırmadan elde edilen Mut17 daha az dsRNA üretir
T7 RNAP'ı daha da optimize etmek için, üretim gereksinimlerini karşılarken düşük dsRNA içeriğine sahip dört varyant seçildi.Araştırmacılar daha sonra bir DNA karıştırma kütüphanesi oluşturdular ve mikrotitre plakalarıyla tarayarak, ebeveyn T7 RNAP'ına kıyasla daha düşük dsRNA üretimi gösteren Mut17 (A70Q/F162S/K180E) adlı bir varyantı tanımladılar. Daha sonra Mut17'nin ve ebeveyn varyantlarının (Mut14, Mut11 ve Mut7) transkripsiyonel ürünlerini analiz ettiler. Şekil 5, dört varyantın hepsi, vahşi tipe kıyasla transkripsiyon sırasında dsRNA üretiminde önemli azalmalar gösterdi. Dikkat çekici bir şekilde, Mut17, tarama çözücü sisteminde yalnızca %1,80 ve 0,007 ng/μg kadar düşük olan önemli ölçüde daha düşük dsRNA içeriği gösterdi.
Şekil 5. Mut17'nin ve ebeveyn mutasyonlarının dsRNA içeriği
Mutanttan elde edilen IVT ürününün immünojenitesi, vahşi tipten önemli ölçüde daha düşüktür.
Sonraki, Fare RA'sında IVT ürünlerinin immünogenitesini değerlendirdikW264.7 hücreler. Şekil 2A ve 2B'de gösterildiği gibi, IFN-β mRNA ve protein düzeyleri RA'da azaldıW264Mutantlar tarafından üretilen mRNA ile transfekte edilen .7 hücre, vahşi tip ile karşılaştırıldığında, vahşi tip T7 RNAP tarafından sentezlenen mRNA'nın en güçlü bağışıklık tepkisini ortaya çıkardığını, mutantlardan elde edilen mRNA'nın ise önemli ölçüde daha düşük bir tepki gösterdiğini göstermektedir. Özellikle, Mut11 RNA ile tedavi edilen hücrelerin IFN-β mRNA'sı, vahşi tipte tedavi edilen hücrelerin yalnızca %9,7'siydi ve proteini 12,93 pg/mL idi. Dahası, EGFP ekspresyonu, farklı T7 RNAP'leri tarafından üretilen mRNA'lar arasında miktar veya kalite açısından önemli bir fark göstermedi (Şekil 6C), endüstriyel uygulamalar için gereksinimleri karşılamaktadır.
Şekil 6. Memeli hücrelerinde IFN-β yanıtı ve EGFP ekspresyonu
Mutantın RDRP ve terminal transferaz aktiviteleri çok düşükBizr, vahşi tiptekilerden daha fazladır.
Mutasyonların dsRNA'yı azaltmadaki etkisini araştırmak için araştırmacılar tüm bu mutasyonlar üzerinde silico çalışmalar yürütüldü. Sonuç, varyantlarda RDRP aktivitesinin azaldığına dair açık bir gösterge olduğunu gösteriyor, çünkü RNA'yı şablon olarak kullanma eğilimi azaldı. Benzer şekilde, bunun T7 RNAP'nin terminal transferaz aktivitesi üzerinde bir etkisi olmuş olabilir. Gösterildiği gibi Figür 7Farklı konsantrasyonlarda, 4 varyantın tamamı vahşi tipe kıyasla %50'den daha az floresan değeri sergiledi.
Daha sonra, T7 RNAP'ın terminal transfer aktivitesini karakterize etmek için 3'-uç heterojenlik testi kullanıldı. n>0 olan RNA oranına odaklanıldığında, bu terminal transferaz aktivitesini yansıtır, araştırmacılar Bu RNA'ların vahşi tipte %82,94'ünü oluşturduğunu, mutantların ise şu yüzdeleri sergilediğini buldu: Mut11 (%70,29), Mut7 (%67,88), Mut14 (%63,31) ve Mut17 (%55,62) (Figür 8)Önemlisi, bu yüzdeler ürünlerdeki dsRNA bolluğuyla oldukça tutarlıdır (Şekil 5)Bu sonuçlar mutantların terminal transferaz aktivitesinde önemli bir azalma olduğunu ve bunun RDRP aktivitesindeki azalmayla birlikte dsRNA'daki azalmaya katkıda bulunduğunu göstermektedir.Özellikle, terminal transferaz aktivitesi, Mut17'de gözlemlenen en düşük n>0 RNA birikimiyle kanıtlandığı gibi daha önemli bir rol oynayabilir; bu aynı zamanda en düşük dsRNA üretimini de sergiler. (Şekil 5 ve Şekil 8).
Figür 7. Göreceli RDRP etkinliği
Figür 8RNA ürünlerinin 3'-ucundaki heterojenlik
Çözüm
Bu çalışma, azaltılmış dsRNA içeriğine sahip mutantları tanımlamak için sağlam bir metodoloji sunar ve azaltılmış RNA-bağımlı RNA polimeraz ve terminal transferaz aktivitesine sahip birden fazla dsRNA mutantını başarıyla izole eder. mRNA terapötiklerinin ayrılmaz bir parçası olan güvenlik ve etkinliğin doğrulanmasını önemli ölçüde destekler ve mRNA aşılarını ve gen terapisi uygulamalarını ilerletmek için derin etkilerini vurgular.
Aynı zamanda ana şirket Yeasen Ayrıca, dsRNA'yı önemli ölçüde azaltan bir T7 RNAP ürünü de piyasaya sürdü içerik. Birçok ortak, Molefuture tarafından geliştirilen modifiye edilmiş T7 RNAP mutantlarını zaten test etti ve ürün müşteriler tarafından oldukça beğenildi. Müşterilerimiz yeni enzimin kullanımının mRNA'nın saflaştırma sürecini basitleştirdiğine inanıyor ve IVT'nin immünogenitesini büyük ölçüde azaltır ürünleri, biyofarmasötik alanında geniş uygulama potansiyelini kanıtlayarak, çoklu uygulama senaryolarında olağanüstü performans göstermektedir!
Sipariş Bilgileri
Aşağıdakiler Yeasen tarafından sunulan temsili ürünlerdir. Ek boyutlar mevcuttur. Ürünlerimiz, üstün performans ve yeniden üretilebilirliği garanti altına almak için uyumlu bir şekilde çalışmak üzere son derece optimize edilmiştir. Ayrıca özelleştirilmiş hizmetler de sağlayabiliriz. Gösterilmeyen bir ürünle ilgileniyorsanız, bizimle iletişime geçin ve ihtiyaçlarınızı karşılamak için sizinle birlikte çalışalım.