Yeni nesil dizileme (NGS), yüksek tespit duyarlılığı, güçlü özgüllüğü ve hem nitel hem de nicel tespit yapabilme yeteneği nedeniyle patojen tespiti, tümör mutasyon tespiti ve üreme genetiği gibi alanlarda son derece geniş klinik ve bilimsel araştırma uygulama beklentileri göstermiştir. NGS'de temel bir adım olan kütüphane oluşturma, dizileme kalitesini doğrudan etkiler. In vitro diagnostik (IVD) ürünleri için kayıt inceleme yönergelerine dayanarak, ana hammaddelerin araştırma verilerinin sağlanması gerekir. Hammaddelerin temel bilgileri, parametre göstergeleri ve tedarik kaynakları gibi faktörleri birleştirerek kapsamlı bir analiz ve doğrulama yapılmalı ve en uygun hammadde kaynağı belirlenmelidir. Geleneksel DNA ve RNA kütüphanesi oluşturma süreci esas olarak cDNA sentezi, DNA parçalanması, adaptör ligasyonu ve kütüphane amplifikasyonu gibi temel adımları içerir. Çeşitli adımlar birçok ham madde enzimi türünü içerir. Ham madde enzimlerinin taranması araştırma döngüsünü uzatır. Bu temelde, maliyet etkin ve basit kütüphane inşa modülü ürünleri IVD ürünlerinin geliştirilmesinde yeni bir tercih haline gelmiştir.
Şekil 1. Geleneksel DNA kütüphanesi oluşturma süreci (sol) ve RNA kütüphanesi oluşturma süreci (sağ), örnek olarak Illumina platformunu ele alıyor
Ters transkripsiyon sentezi temel kısımdır RNA-Seq'in, Yeni yüksek tip yüksek hassasiyet, yüksek verimlilik, yüksek transkriptaz gibi birden fazla işlevi bir araya getiren ters transkriptaz teslim olmak cDNA'nın yapısı ve karmaşık yapıların şablonlarıyla uyumluluğu, araştırmaların odak noktasıdır. Yeasen'in ZymeEditor™ enzim modifikasyon platformu, M-MLV'nin yönlü modifikasyonu yoluyla kapsamlı bir şekilde iyileştirilmiş performansa sahip çok yönlü bir ters transkripsiyon ürünü elde etti. RNA-seq, tek hücre dizilemesi, cDNA klonlama ve kütüphane oluşturma gibi birden fazla uygulama senaryosunda kullanılabilir.
Şekil 2. RNA-seq'te uygulanan 13488ES'nin performansı
Dizileme platformunun kısa okuma uzunluğu nedeniyle, kütüphane oluşturulmadan önce DNA'nın rastgele parçalanması gerekiyor. Başlangıçta, enzimatik parçalanma, tekdüzelik ve önyargı sorunları nedeniyle göz korkutucuydu. Yeasen Biyoteknoloji iki benzersiz parçalanma enzimi geliştirdi, 37℃'de işlev gören güçlü etkili bir parçalanma enzimi 3-30 dakika boyunca ve 30℃'de işlev gören hafif etkili bir parçalanma enzimi 10-40 dakika kadar. Rastgele parçalanmaya dayalı enzimatik parçalanma ürünlerinin eksiklikleri giderek giderilmektedir. Farklı numunelerin ve farklı dizileme tiplerinin çok sayıda talebini karşılayan DNA parçalanması, uç onarımı ve A-kuyruğu için modüler ürünler halinde bir araya getirilmişlerdir.
Şekil 3. Farklı DNA parçalanma enzimlerinin parçalanma etkileri: kuvvetli etkili parçalanma enzimi (sol) ve hafif etkili parçalanma enzimi (sağ)
Kütüphane dönüşüm oranı, kütüphane kalitesini değerlendirmek için önemli bir göstergedir. Yüksek bir kütüphane dönüşüm oranı, bir bakıma daha iyi kütüphane zenginliği ve dizileme verilerinin daha iyi bir şekilde bir arada olması anlamına gelir. Konvansiyonel T4 DNA ligazı, yüksek verimli ligasyonu optimize etmeye odaklanır, ancak parçalar kendi kendine ligasyona eğilimlidir, bu da kütüphane dönüşüm oranını azaltır ve kütüphane zenginliğini ve dizileme kalitesini etkiler. Yeasen ZymeEditor™ enzim mühendisliği platformu, yeni bir mutant elde etmek için T4 DNA Ligaz üzerinde yönlü modifikasyon gerçekleştirir. Dikkatlice optimize edilmiş bir ligasyon tamponu ile birleştirilen, yüksek termal kararlılığa ve düşük parça kendi kendine ligasyon oranına sahip ligasyon modülü ürünü geliştirilmiştir; bu da kütüphane dönüşüm oranını önemli ölçüde iyileştirir.
Şekil 4. Termal kararlılık ve bağlayıcı kalıntı analizi 12996ES
NGS kütüphane hazırlama yöntemlerinde PCR amplifikasyon enzimlerine ihtiyaç duyulmaktadır. En yüksek doğruluktaki DNA polimerazlarının çoğu 5'→3' polimeraz aktivitesine ve 3'→5' ekzonükleaz aktivitesine sahiptir. Hatalı olarak eklenen bazları düzeltirken 5'→3' yönünde DNA sentezleyebilir, Bu sayede DNA parçaları hızlı ve yüksek doğrulukla çoğaltılabilmektedir. Ancak çok az enzim özellikle NGS için tasarlanmıştır. Farklı boyutlardaki ve GC içeriklerindeki hedefleri önyargısız bir şekilde çoğaltabilen, aynı zamanda primerleri önceden karıştırma yeteneğine sahip, verimli, doğru, özgül çok fazla kütüphane amplifikasyon ürünü bulunmamaktadır. Yeasen Biotechnology, benzersiz bir tasarıma ve optimize edilmiş bir sıcak başlatma PCR ön karışımına sahip son derece hassas bir DNA polimeraz geliştirdi. Bu, karmaşık NGS kütüphane amplifikasyonunun zorluklarını ele alarak, özellikle verimli, yüksek doğrulukta ve düşük önyargılı NGS kütüphane amplifikasyonu için tasarlanmıştır.
Şekil 5. 12980ES'nin kararlılık ve amplifikasyon hata oranı analizi
Yukarıdaki NGS kütüphanesi oluşturma modülü ürün serisine ek olarak, Ayrıca tek elden ham enzim ürünleri de sağlıyoruz. farklı müşterilerin ortak ihtiyaçlarını karşılamak. Yeasen'in NGS kütüphane inşaat hammadde ürünleri, sıkı fabrika kalite kontrol standartlarına, sıkı parti performansına ve stabilite kalite kontrolüne tabi tutulur, böylece endişelenmeden kütüphaneler inşa edebilirsiniz.
| Ürün kategorisi | Ürün adı | Kat.No. | Açıklama |
| Verimli cDNA sentezi | Hifair™ Ultra Ters Transkriptaz (200 U/μL) | 14604ES | Ters transkripsiyon enzimi |
| Yüksek NGS™ ds-cDNA Sentez Kiti | 13488ES | cDNA sentez modülü | |
| DNA Parçalanma ve Uç Onarımı ve A- Kuyruklama | Hieff™ Smeraz | 12907ES | DNA fragmantazı |
| Hieff NGS™ OnePot Pro DNA Parçalanma Modülü (uç onarımı ve dA-tailing plus) | 12619TS | DNA Parçalanma ve Son Onarım ve A- Kuyruk modülü | |
| Onarım ve A-Tailing | Hieff NGS® Hızlı Son Onarım/dA-Tailing Modülü | 12608ES | Son Onarım ve A- Kuyruk Modülü |
| Adaptör ligasyonu | 10299ES | T4 DNA ligazı | |
| Kütüphane amplifikasyonu | 2× Ultima HF Amplifikasyon Miksajı | 13344ES | Yüksek doğruluklu enzim |