Yüksek verimli dizilemede, geleneksel kütüphane inşası PCR amplifikasyonu gerektirir. Bir yandan, iz DNA örneklerini çoğaltmak ve kütüphane verimini artırmak içindir. Öte yandan, floresan sinyallerini çoğaltabilir ve dizileyicilerin floresan sinyallerini yakalayıp tanımlamasını kolaylaştırarak dizileme doğruluğunu artırır. Ancak, PCR "çift taraflı bir kılıç" gibidir. Düşük başlangıç ​​örnek hacmi sorununu çözerken ve floresan sinyalini çoğaltırken, aynı zamanda çoğaltma hataları ve önyargıları da getirir ve genom dizisinin "Gerçek yüzünü" mükemmel bir şekilde sunamaz. Ek olarak, PCR polimerazının belirli bir çoğaltma önyargısı vardır. Bazı bölgeler, özellikle yüksek GC veya düşük GC, ikincil yapı ve diğer bölgeler düşük çoğaltma verimliliğine sahiptir ve kapsanması zordur. Ayrıca çok sayıda yanlış InDel getirecek ve çok sayıda Çoğaltma getirecektir. , DNA veri hacminin israfına neden olacak ve dizileme maliyetini artıracaktır. Bu nedenle, PCR-Free teknolojisinin tanıtımı yalnızca PCR'nin avantajlarına sahip olmakla kalmaz, aynı zamanda PCR'nin eksikliklerini de giderir. Yalnızca yüksek hassasiyete sahip yüksek kaliteli kütüphaneler getirmekle ve eser örneklerin tespitini gerçekleştirmekle kalmaz, aynı zamanda yüksek doğruluğa sahiptir ve varyant çalışmaları için takip Doğrulama iş yükünü azaltır. Peki PCR-Free kütüphanesi tam olarak nedir ve avantajları nelerdir?

1. PCR-Free kütüphanesi nedir?
2. PCR-Free teknolojisinin avantajları nelerdir?
3. PCR-Free'nin veri gösterimi
4. SSS
5. Ürün bilgisi
6. Okuma ile ilgili

1. PCR-Free kütüphanesi nedir?

Yeni nesil dizileme teknolojisi, modern moleküler biyolojide yüksek verimli dizileme araştırmalarında en sık kullanılan teknolojidir. Geleneksel birinci nesil dizileme artık araştırmacıların ihtiyaçlarını tam olarak karşılayamıyor. Model organizmaların genom yeniden dizilenmesi ve model olmayan organizmaların genom dizilenmesi daha fazla maliyet gerektiriyor. Düşük, daha yüksek verimli, daha hızlı dizileme teknolojisi, böylece ikinci nesil dizileme teknolojisinin doğmasına yol açıyor. İkinci nesil dizileme teknolojisinin temel ilkesi, sentez yoluyla dizilemedir, yani yeni sentezlenen uç etiketli baz bilgisini yakalayarak DNA dizisini belirlemektir. DNA dizilemesi için ikinci nesil dizileme teknolojisinin temel ilkesi, önce DNA'yı parçalamak, parçalanmış DNA'nın ucunu onarmak ve ardından her iki tarafa spesifik adaptörler eklemek ve ardından milyonlarca uzamsal olarak sabitlenmiş PCR üretmek için farklı yöntemler kullanmaktır. Klonal diziler için, her bir uzatma reaksiyonu ile birleştirilen floresan etiketlerin görüntülenmesi için primer hibridizasyonu ve enzimatik uzatma reaksiyonları kullanılarak dizileme verileri elde edilir.

Yeni nesil dizileme ile DNA dizilemesi esas olarak iki süreci içerir: kütüphane hazırlama ve makinede dizileme. Kütüphane hazırlama sırasında, rastgele kesintiye uğramış genomik parçalar tipik olarak standart PCR ile çoğaltılır. Ancak, bazı özel şablonlar için, şablon PCR'nin çoğaltma tercihini etkileyen karmaşık ikincil yapı veya zayıf termal kararlılık gibi faktörler vardır, bu nedenle tüm genomik diziler PCR çoğaltma kütüphanesine eşit şekilde yansıtılamaz. Özellikle yüksek GC veya yüksek AT içeriğine sahip bazı şablonlar için, bazen kütüphane inşası için çoğaltmak üzere PCR yöntemini kullanmak zor olabilir. Makinede dizileme yaparken PCR içermeyen kütüphane ile geleneksel PCR kütüphanesi arasında, kütüphane inşa süreci sırasında PCR gerçekleştirilmemesi dışında hiçbir fark yoktur. PCR içermeyen kütüphane, teorik olarak veri okumalarının dağıtımını iyileştirebilir ve daha düzgün genom kapsamı oluşturabilir.PCR içermeyen kütüphane, kütüphane oluşturma yöntemine bir ektir. PCR amplifikasyonu olmadan doğrudan yerleşik bir kütüphaneye hazırlandığından, bazı yüksek GC veya yüksek AT bölgelerinin kapsamını iyileştirebilir ve böylece PCR, Veri önyargısı ve dizi tekrarı tarafından ortaya çıkarılan hata tabanlarını azaltabilir.

Geleneksel NGS kütüphane inşasının temel adımları genom parçalanması, uç onarımı, adaptör eklenmesi, PCR ve dizilemeden önce sinyal amplifikasyonudur. Peki, PCR'siz kütüphane inşası ne olacak? Adından da anlaşılacağı gibi, PCR gerektirmeyen bir kütüphane inşa sürecidir. Kütüphane inşasının temel adımları genom parçalanması, uç modifikasyonu, bağlayıcı eklenmesi ve kütüphane kalite kontrolüdür. Ancak gerçekte, bu yalnızca kütüphane inşa sürecinde PCR'siz olarak kabul edilebilir. Gerçek PCR'siz, kütüphane inşasından dizilemeye kadar kütüphane amplifikasyonu olmadan (tek moleküllü dizileme teknolojisi gibi) veya PCR amplifikasyon hatalarının birikimi olmadan bir dizileme teknolojisi (MGI'nin DNBseq gibi) bir süreç olmalıdır.

Şekil 1. Geleneksel kütüphane yapımının ve PCR içermeyen kütüphane yapımının akış şeması

2. PCR-Free teknolojisinin avantajları nelerdir?

Rutin kütüphane oluşturma sürecinde, amplifikasyon enzimi hatalara neden olabilir. Döngüsel amplifikasyon yoluyla, bu hatalar biriktirilecek ve çoğaltılacak ve DNA dizisi replikasyonunun doğruluğu azalacaktır. Ek olarak, DNA polimerazı, özellikle GC içeriği veya ikincil yapılarda büyük farklılıklar olan bölgeler için belirli bir amplifikasyon önyargısına sahiptir ve bu da düşük amplifikasyon verimliliği ve zayıf kapsama tekdüzeliği ile sonuçlanır; yanlış InDels'i tanıtırken, çok sayıda Çoğaltma, DNA veri hacminin israfına neden olur ve dizileme maliyetlerini artırır. PCR-Free teknolojisi, geleneksel kütüphane oluşturmada PCR amplifikasyonunun getirdiği yukarıda belirtilen sorunlardan iyi bir şekilde kaçınabilir. Kütüphane oluşturma ve dizileme sürecinde, bir PCR amplifikasyon süreci varsa, genom kapsamının tekdüzeliği üzerinde daha büyük bir etkiye sahip olacaktır. DNA şablonları için, bazıları karmaşık ikincil yapılara ve bazıları termal kararlılıkta büyük farklılıklara sahiptir. Bu faktörler PCR amplifikasyonunun verimliliğini etkileyecektir. Bu nedenle, PCR amplifikasyon sürecinde, tüm genomik parçaların aynı amplifikasyon verimliliğini elde edebileceği garanti edilemez, ancak genomun yüksek GC veya düşük GC bölgelerinde düşük kapsama gibi belirgin bir amplifikasyon önyargısı vardır. Ancak, PCR'siz dizilemenin tüm sürecinde PCR yoktur. PCR kütüphanesi inşasıyla karşılaştırıldığında, genomun yüksek GC bölgelerinin ve AT/TA tekrar bölgelerinin kapsamı iyileştirilmiştir. Belirli avantajlar aşağıdaki gibidir.

2.1 Zamandan tasarruf sağlayan, akıcı kütüphane hazırlama süreci

PCR'siz kütüphane hazırlama, PCR amplifikasyonuna ve diğer adımlara olan ihtiyacı ortadan kaldırarak kütüphane hazırlama sürecini hızlandırır ve zamandan tasarruf sağlar.

2.2 Kütüphane hazırlama maliyetinin azaltılması

Geleneksel kütüphane hazırlama sürecinde, dizi gerçekliğini sağlamak için PCR amplifikasyonu için pahalı yüksek doğruluklu enzimler kullanılır. Aynı zamanda, PCR-Free, PCR amplifikasyon adımını ortadan kaldırarak kütüphane hazırlama maliyetlerini azaltır.

2.3 Amplifikasyon önyargısını azaltın

DNA amplifikasyon enzimleri, özellikle GC içeriği veya ikincil yapıda önemli farklılıklara sahip şablonlar için belirli amplifikasyon önyargılarına sahiptir. Bu nedenle, PCR-Free polimerazın neden olduğu amplifikasyon önyargısından etkili bir şekilde kaçınabilir.

2.4 PCR Kopyalaması Yok

PCR-Free, Tekrarlanan okumaları azaltabilir ve Benzersiz Eşleme oranlarını ve etkili veri kullanımını artırabilir.

2.5 Azaltılmış Hata Pare

PCR amplifikasyonunun, İnsersiyon ve Silme replikasyon hatalarını ortaya çıkarma olasılığı daha yüksektir ve bu da İndel dizilemesinin daha yüksek Hata Oranına yol açarken, PCR-Serbest, bu tür hataların oluşmasını ve birikmesini etkili bir şekilde önleyebilir.

3. PCR-Free'nin veri gösterimi

Hieff NGS™ Ultima Pro PCR Ücretsiz DNA Kütüphane Hazırlık Kiti V2 (Cat# 12196ES) rakip ürünlere göre daha iyi bir kütüphane dönüşüm oranına sahiptir.

Şekil 2. PCR'siz kütüphane inşası için makine dışı dizileme verilerinin miktarı

4. SSS

S: PCR'siz kütüphaneler için hangi tip örnekler uygundur?

A: Karmaşık sekonder yapılara sahip, yüksek GC ve PCR tercihine sahip bazı örnekler, PCR içermeyen bir kütüphane oluşturmak için seçilebilir.

S: PCR içermeyen kütüphanenin genel fragman boyutu nedir?

A: PCR içermeyen kütüphanenin kendisinin parça boyutu konusunda özel gereksinimleri yoktur. PCR ürünü kütüphanesi, kütüphane PCR ürününün boyutuna göre oluşturulmuştur. Genomik kütüphane için, kütüphane verilerinin kalitesinin nispeten iyi olması için yaklaşık 350 bp olması önerilir.

5. Ürün bilgisi

Yeasen’in sağlayabileceği ürün Tablo 1’de gösterilmektedir.

Tablo 1. Ürün bilgisi

6. Okuma ile ilgili

DNA örneklerinden NGS kütüphanesi hazırlama çözümü

NGS ile ilgili teknoloji hakkında ne kadar bilginiz var?