Tanım
T7 Yüksek Verimli RNA Sentezi Kiti transkripsiyon reaksiyon sistemini optimize eder. Kit, şablon olarak T7 promotör dizisine sahip doğrusal çift sarmallı DNA olan T7 RNA polimerazını, promotörün aşağı akışındaki DNA dizisini kontrol etmek için substrat olarak NTP'leri kullanarak tek sarmallı RNA'yı verimli bir şekilde sentezleyebilir. Transkripsiyon sırasında, biyotin veya boya etiketli RNA hazırlamak için substrata modifiye nükleotidler eklenebilir.
Bu kit uzun transkriptleri ve kısa transkriptleri sentezleyebilir, RNA 1 μg DNA şablon girişiyle 100-200 μg üretilebilir. Transkripsiyonla sentezlenen RNA, RNA yapısı ve işlevi araştırması, RNase koruması, prob hibridizasyonu, RNAi, mikroenjeksiyon ve in vitro gibi çeşitli alt akış uygulamaları için kullanılabilir. çeviri.
Şekil 1: In vitro RNA transkripsiyon süreci
Özellik
- 1 μg kontrol şablonundan reaksiyon başına 180 μg'a kadar RNA
- IVT prosesi için optimize edilmiş reaksiyon sistemi
- dsRNA üretimini azaltın
- Daha yüksek RNA bütünlüğü ve saflığı
Başvuru
- In vitro RNA sentezi
Bileşenler
| Bileşenler No. | İsim | 10623ES50 (50 T) | 10623ES60 (100 T) | 10623ES70 (500 T) |
| 10623-A | T7 RNA Polimeraz Karışımı | 100 μL | 200 μL | 1 ml |
| 10623-B | 10×Transkripsiyon Tamponu | 100 μL | 200 μL | 1 ml |
| 10623-C | ATP (100mM) | 100 μL | 200 μL | 1 ml |
| 10623-D | CTP (100mM) | 100 μL | 200 μL | 1 ml |
| 10623-E | GTP (100mM) | 100 μL | 200 μL | 1 ml |
| 10623-F | UTP (100mM) | 100 μL | 200 μL | 1 ml |
| 10623-G | Kontrol DNA Şablonu (500ng/μL) | 10 μL | 20 μL | 100 μL |
Nakliye ve Depolama
Kuru buz taşımacılığı. -15℃ ~ -25℃'de saklayın, iki yıl geçerlidir.
Rakamlar
Şekil 1. Standart RNA, T7 RNA sentez kiti kullanılarak in vitro sentezlendi.
Reaksiyon 37℃'de 2 saat boyunca bir PCR cihazında inkübe edildi ve ardından manyetik boncuklarla (Cat#12602) saflaştırıldı. Verim sonucu Şekil 1'de gösterildiği gibi NanoDrop spektrofotometresi ile analiz edildi.
Şekil 2. Elektroforetogramda (Şekil 2A), kapiler elektroforez diyagramında (Şekil 2B) ve kromatogramda (Şekil 2C) sırasıyla T7 kiti ile farklı RNA uzunluklarının transkripsiyon gösterimi
Şekil 3. İn vitro kapalı RNA sentezi.
Reaksiyon 2 saat boyunca 37℃'de PCR cihazında inkübe edildi ve ardından manyetik boncuklarla (Cat#12602) saflaştırıldı. Verim sonucu Şekil 3A'da gösterildiği gibi NanoDrop spektrofotometresi ile ölçüldü. Bütünlük sonucu Şekil 3B'de gösterildiği gibi kapiler elektroforez ile analiz edildi.
1. Düşük transkript verimi
Şablonun kalitesi verimle yakından ilişkilidir. Deney grubunun verimi kontrol grubundan önemli ölçüde düşükse, olası nedenler şunlardır:
① deneysel şablon inhibitör bileşenleri içerir;
② Şablonda bir sorun var.
Öneriler:
① Şablonu yeniden arındırın;
② Şablonun niceliğini ve bütünlüğünü belirleyin;
③ Tepkime süresini uzatın;
④ Şablon girişinin miktarını artırın;
⑤ Diğer promotörleri ve RNA polimerazları deneyin.
2. Kısa transkriptlerin düşük verimi
Kısa bir transkripsiyon başlatma parçası reaksiyonu inhibe edecektir. Transkripsiyon ürünü 100 nt'den az olduğunda, reaksiyon süresini 4-8 saate uzatmak veya şablon miktarını 2 μg'a çıkarmak RNA verimini artıracaktır.
3. RNA transkripsiyon uzunluğu beklenenden daha uzundur
Elektroforez sonucunda ürün bandının beklenenden daha büyük olduğu görülürse olası nedenler şunlardır:
①Plazmit şablonu tamamen doğrusallaştırılmamış olabilir;
②Duyusal ipliğin 3' ucu belirgin bir yapıya sahiptir;
③RNA'nın tamamen denatüre olmamış ikincil bir yapısı vardır.
Öneriler:
①Şablonun tamamen doğrusallaştırılmış olup olmadığını kontrol edin ve gerekirse ek doğrusallaştırma yapın;
②3' çıkıntılarını önlemek için uygun bir restriksiyon enzimi seçin veya devam etmeden önce transkripsiyonu tamamlamak için Klenow Fragment/T4 DNA polimerazını kullanın;
③RNA ürünlerini tespit etmek için denatüre jel kullanın.
4. RNA transkripsiyon uzunluğu beklenenden daha azdır
Elektroforez sonucunda ürün bandının beklenen boyuttan daha küçük olduğu görülürse olası nedenler şunlardır:
①Şablon, T7 RNA polimerazına benzer bir sonlandırma dizisi içerir;
②Şablondaki GC içeriği yüksektir.
Öneriler:
①Tepkime sıcaklığını düşürün (örneğin, 30°C). Bazen sıcaklığı düşürmek transkripsiyon uzunluğunu artırabilir, ancak verimi azaltacaktır. Veya transkripsiyon için farklı RNA polimerazları deneyin;
②Şablon GC içeriği yüksekse, 42℃ kullanın transkript etmek veya verimi ve transkripsiyon uzunluğunu artırmak için SSB eklemek.
5. Transkripsiyon ürünlerinin elektroforez kuyruğu
Elektroforez sırasında kuyruklanma olayı meydana gelir.
Olası nedenler:
①Deneysel işlem sırasında RNase ile kirlenmiştir;
②RNase ile kontamine DNA şablonu.
Öneriler:
①RNase içermeyen pipet uçları ve EP tüpleri kullanın, tek kullanımlık lateks eldiven ve maske takın ve tüm reaktifler RNase içermeyen H2O ile hazırlanmalıdır.
②Şablon DNA’yı tekrar saflaştırın.
[1] Dong Z, Zheng N, Hu C, ve diğerleri.Nosema bombycis mikroRNA benzeri RNA 8 (Nb-milR8), Konağı Bombyx mori'de BmPEX16 Gen Ekspresyonunu Düzenleyerek Mantar Patojenitesini Artırır. Mikrobiyoloji Spektr. 2021;9(2):e0104821. doi:10.1128/Spectrum.01048-21(IF:7.171)
[2] Wang X, Tang S, Ye S, ve diğerleri. Üçlü zincir yer değiştirme amplifikasyon kaskadı ile dolaşan miR-195-5p'nin ultra hassas kantifikasyonu. Talanta. 2022;242:123300. doi:10.1016/j.talanta.2022.123300(IF:6.057)
Ödeme ve Güvenlik
Ödeme bilgileriniz güvenli bir şekilde işlenir. Kredi kartı ayrıntılarını saklamıyoruz veya kredi kartı bilgilerinize erişimimiz yok.
Sorgu
Ayrıca sevebilirsiniz
SSS
Ürün yalnızca araştırma amaçlıdır ve insanlarda veya hayvanlarda terapötik veya teşhis amaçlı kullanım için tasarlanmamıştır. Ürünler ve içerikler, Yeasen Biotechnology'nin sahip olduğu patentler, ticari markalar ve telif haklarıyla korunmaktadır. Ticari marka sembolleri, tüm bölgelerde tescilli olmayıp, menşe ülkesini gösterir.
Bazı uygulamalar üçüncü tarafların ek fikri mülkiyet haklarına ihtiyaç duyabilir.
Yeasen, araştırmalarımızın güvenlik ve etik standartları sağlarken kritik soruları ele alması gerektiğine inanarak etik bilime kendini adamıştır.