Hieff^™ Hızlı Hücre Doğrudan SYBR Green boyasına dayalı RT-qPCR Kiti, RNA çıkarmaya gerek kalmadan her türlü hayvan hücresinden (hücre soyu duvar hücreleri ve süspansiyon hücreleri, birincil kültür hücreleri, çeşitli kök hücreler, iPS hücreleri vb.) RNA ekstraksiyonu için uygundur ve kısa, kullanımı kolay ve düşük hata oranına sahip olan qPCR ekspresyon analizi için doğrudan kullanılabilir. Şablon hazırlamadan ters transkripsiyon reaksiyonuna ve gen ekspresyon analizine kadar olan adımları tamamlamak sadece 1,5 saat sürer.

Kit içerisinde ters transkripsiyon ve floresan tespit reaktifleri bulunmakta olup, ilave reaktif satın almaya gerek kalmadan gen ekspresyon analizinde kullanılabilmektedir.

Özellikler

Bileşenler

Depolamak

Kontaminasyonu önlemek amacıyla FCD Lizis Tamponu ve FCD Yıkama Tamponu eritilerek 4°C'de saklandı. FCD Stop Solüsyonu、DNase I、4× Hifair™ FCD RT Karışımı、2× Hieff™ FCD qPCR SYBR Master Karışımı -25~-15℃'de saklanmalıdır.

Talimatlar

1. Bölünme ürünlerinin hazırlanması

1)1. Reaktifi oda sıcaklığında eritin, ters çevirip kullanmadan önce hafifçe karıştırın ve köpürmesini önlemek için hafif santrifüjledikten sonra kullanın*.

*Reaktiflerin karıştırılmaması, karıştırma işlemi için osilatör kullanılması, reaktiflerin buz üzerinde yapılandırılmaması reaksiyon performansının düşmesine neden olabilir.

2)Hücre tipine bağlı olarak**, hücreleri bir santrifüj tüpüne aktarın ve hücreleri toplamak ve ortamı iyi bir şekilde aspire etmek için 5000 rpm'de 2 dakika santrifüj edin. Hücreler 96-kuyulu plakalarda kültürlenirse, ortam doğrudan aspire edilebilir.

​​​​​​​3)Her kuyuya 150 μL FCD Yıkama Tamponu ekleyin, hücreleri üfleyerek yıkayın, 5000 rpm'de 2 dakika santrifüj edin ve FCD Yıkama Tamponunu aspire edin***.

​​​​​​​4)Her kuyucuğa 48 μL FCD Lizis Tampon Çözeltisi ve 2 μL DNase Ⅰ Çözeltisi ekleyin, oda sıcaklığında üfleyin ve karıştırın, ardından 5 dakika bekletin ve ardından 2 ekleyin.İnkübasyondan sonra 5 μL FCD Durdurma Solüsyonu**** eklenir ve ardından yaklaşık 5 kez üflenerek karıştırılarak ayrışma ürünü***** elde edilir.

** Hücre sayısının temel gereksinimi 1 × 10'dur⁴ kuyu başına hücre ve bu kit 1 × 10 aralığında kullanılabilir³ - 1 × 10⁶ Hücre sayısı fazla ise FCD Lizis Tamponu çözeltisi ve DNaseⅠçözeltisinin miktarı uygun şekilde orantılı olarak artırılabilir.

*** Santrifüjleme koşulları hücreden hücreye değiştiği için, lütfen kullanılan hücrelere uygun hızda santrifüjleyin.

**** 50 μL lizata 2,5 μL FCD Stop Solüsyonu ekleyin ve gerektiği şekilde FCD Stop Solüsyonu miktarını artırın.

***** Hücre lizis ürünü çözeltilerinin uzun süreli saklanması için -20°C'ye yerleştirin.

5）4 x Hifair™ FCD RT Mix'i oda sıcaklığında eritin ve hafifçe ters çevirerek karıştırın, buz üzerine koyun ve reaksiyon sistemini aşağıdaki tabloya göre yapılandırın:

*******Tavsiye edilen kullanım düzeyi 2-5 μL'dir, %45'i geçmemeye çalışın.

1. Ters transkripsiyon

Yukarıda hazırlanan reaksiyon solüsyonunu pipetleyip yavaşça karıştırın ve aşağıdaki tabloda yer alan prosedüre göre ters transkripsiyon reaksiyonunu gerçekleştirin:

* Önerilen ters transkripsiyon sıcaklığı 55°C'dir. Yüksek GC içerikli şablonlar veya karmaşık şablonlar için ters transkripsiyon sıcaklığı 60°C'ye çıkarılabilir. Ters transkripsiyon ürünü doğrudan aşağı akış RT-qPCR tespiti için kullanılabilir. Ters transkripsiyon sistemi tarafından qPCR reaksiyonunun inhibisyonunu önlemek ve uygun Ct değerini (10-35) elde etmek için ürün 10-1000 kat seyreltilebilir ve ardından kullanılabilir. Kısa bir süre aşağı akış deneyleri yapılmazsa, -20℃'ye kadar saklanabilir.

1. Floresan kantitatif PCR

1)Tepki sistem yapılandırma

Reaksiyon çözeltisinin hazırlanmasında (buz üzerinde hazırlama) aşağıdaki oranlar önerilmektedir.

*Ters transkripsiyon ürününün RT-qPCR hacminin 1/10'undan fazlasını eklemeyin. Şablonun yüksek konsantrasyonu kolayca spesifik olmayan amplifikasyona yol açacaktır, uygun seyreltme 5-50 kattır. Önerilen şablon miktarı 4 μL'dir, 6 μL'yi aşmamaya çalışın. Reaksiyon performansı zayıf olduğunda, primer konsantrasyonu 0,2-1,0 μmol/L aralığında ayarlanabilir.

2）Floresan kantitatif PCR amplifikasyon prosedürü (iki adımlı yöntem)

3）Floresan kantitatif PCR için hızlı amplifikasyon prosedürü (iki adımlı yöntem)

* Tavlama/uzatma sıcaklığı ve son uzatma süresi deneysel gereksinimlere göre uygun şekilde ayarlanabilir. Hızlı program genlerin çoğu için uygundur ve standart program bireysel karmaşık ikincil yapı genleri için denenebilir.

Notlar

1. Bu ürün yalnızca araştırma amaçlıdır.
2. Lütfen güvenliğiniz için laboratuvar önlüğü ve tek kullanımlık eldivenlerle çalışın.

Sürüm EN20230908

Belgeler:

Kılavuzlar

11172-Hieff™ Hızlı Hücre Doğrudan. EN20230908.pdf