Yüksek NGS^T.M. OnePot Pro DNA Kütüphane Hazırlık Kiti V3, yeni nesil enzimatik parçalanmaya dayalı bir kütüphane hazırlama kitidir özel olarak geliştirilmiş ve tasarlanmış Aydınlanma &MGI dizileme platformu. Geleneksel kütüphane inşa yöntemleriyle karşılaştırıldığında, bu ürün zahmetli ultrasonik süreci ortadan kaldıran yüksek kaliteli parçalanma enzimleri kullanır. Parçalanma ve uç onarım modüllerini birleştirerek işlemi basitleştirir. Ayrıca, ligasyon modülü için enzimler ve tampon önceden karıştırılmıştır ve kütüphane inşasının zamanını ve maliyetini önemli ölçüde azaltır. Bu, onu otomatik kütüphane inşası için daha uygun hale getirir. Bu kütüphane hazırlama kiti mükemmel bir kütüphane dönüşüm oranına sahiptir ve tüm yaygın hayvanlardan, bitkilerden, mikroorganizmalardan vb. alınan numuneler ve ayrıca FFPE numuneleri için uygulanabilir. Önceki nesil kütüphane yapı kitine dayanarak, bu ürün parçalamada daha yüksek verimlilik sergiliyor, uç onarımı, dA-kuyruklama ve adaptör ligasyonu önceki versiyonlardan daha iyidir. Yüksek doğruluklu enzim, amplifikasyonun tekdüzeliğini ve doğruluğunu önemli ölçüde iyileştirir.

Özellikler

Bileşenler

[Not]: Kit bileşenleri her ikisiyle de uyumludur Aydınlanma &MGI dizileme platformu, eğer tam adaptör kullanıldı, Yüksek NGS^T.M. Primer Karışımı (Yeasen Cat#12190 veya Cat#12191) gereklidir.

Depolamak

Bu ürün -25~-15℃'de saklanmalıdır. 1 yıl.

Notlar

1. Operasyon hakkında

1. Lütfen laboratuvar önlükleri ve tek kullanımlık eldivenlerle çalışın.，Güvenliğiniz için.

2. Bileşenleri oda sıcaklığında çözdürün. Çözüldükten sonra vorteksleyerek iyice karıştırın, tüpleri kısa bir süre döndürün ve daha sonra kullanmak üzere buz üzerine koyun.

3. Her adımın reaksiyon solüsyonunu hazırlarken, iyice karıştırmak veya hafifçe çalkalamak için bir pipet kullanılması önerilir. Şiddetli çalkalama, kütüphane çıktısında bir azalmaya neden olabilir.

4. Çapraz kontaminasyonu önlemek için filtreli pipet uçlarının kullanılması şiddetle önerilir. Farklı numuneleri işlerken pipet uçlarını değiştirdiğinizden emin olun.

5. Uygunsuz işlemler büyük olasılıkla aerosol kontaminasyonlarına neden olarak sonucun doğruluğunu etkileyebilir. PCR reaksiyon karıştırma bölgelerinin ve PCR ürün saflaştırma testi bölgelerinin zorunlu fiziksel izolasyonu önerilir. Kütüphane inşası için özel pipetler gibi ekipmanlarla donatılmıştır. Yüzeyleri %0,5 sodyum hipoklorit veya %10 çamaşır suyu ile silerek her alan için rutin temizlik yapın

6. Bu ürün yalnızca araştırma amaçlıdır.

2. DNA Parçalanması

1. Kit 100 sayfalık ürünlerle uyumludur - 1000 ng giriş DNA'sı. A260/A280 = 1.8-2.0 olan yüksek kaliteli giriş DNA'sının kullanılması şiddetle tavsiye edilir.

2. Metal şelatlama maddesi gibi tuzların yüksek konsantrasyonları giriş DNA'sıyla birlikte tanıtılırsa, aşağıdaki deneyler etkilenebilir. DNA örneğinin elüsyonunu öneriyoruz gdH₂O parçalanma için.

3. Lütfen tabloya bakın 6 standart DNA örneklerinin parçalanma süresi için. Kit düşük parçalanma eğilimine sahiptir ve geniş bir GC kompozisyonu aralığına sahip DNA örnekleri için düzgün GC kapsamı sağlar. Lütfen parçalanma süresini deneysel ihtiyaçlarınıza göre ayarlayın.

4. Doğru parçalanma için reaksiyonu buz üzerinde hazırlayın.

3. Adaptör Ligasyonu

1. Müşterilerin deneysel gereksinimlerine göre seçebilecekleri Illumina veya MGI Uzun Adaptör (Barkodlu Adaptör) kitleri ve kısa Adaptör kitleri mevcuttur.

2. Yüksek kaliteli, ticari adaptörlerin seçilmesi önerildi. Kendi kendine yapılan adaptörler seçilirse, lütfen NGS primer sentezinde deneyimli bir şirkete güvenin ve sıkı kontaminasyon kontrolüne ihtiyaç olduğunu belirtin. Ayrıca, çapraz kontaminasyonu önlemek için DNA tavlama solüsyonunun temiz bir tezgahta hazırlanması ve her seferinde yalnızca bir adaptör türü çalıştırılması önerilir.

3. Lütfen adaptörleri buz üzerinde veya 4°C'de çözdürün; oda sıcaklığında çalıştırıldığında adaptörlerin denatüre olmasını önlemek için laboratuvar sıcaklığı 25°C'yi geçmemelidir.

4. Adaptörlerin kalitesi ve konsantrasyonu, ligasyon verimliliğini ve kütüphane verimini doğrudan etkileyecektir. Çok yüksek adaptör konsantrasyonu, adaptör dimer oluşumunu desteklerken, çok az adaptör, ligasyon oranını ve kütüphane verimini azaltır. Adaptör kullanıldığında Giriş DNA miktarına göre TE Tamponu ile ilgili seyreltmeler. Tablo 1-2 Bu kit, Illumina veya MGI dizileme platformları için farklı miktarlarda Giriş DNA'sı için geleneksel ve UMI Adaptörleri için önerilen seyreltme yöntemlerini listeler.

Masa 1 Önerilen Illumina farklı giriş için adaptör miktarı DNA

Masa 2 Önerilen MGI farklı giriş için adaptör miktarı DNA

4. Boncuk Tabanlı DNA Temizliği ve Boyut Seçimi

1. DNA boyut seçimi uç onarımı/dA kuyruğundan önce, adaptör ligasyonundan sonra veya amplifikasyondan sonra gerçekleştirilebilir.

2. Giriş DNA miktarı 50 ng'dan fazla ise adaptör ligasyonundan hemen sonra boyut seçimi yapılması önerilir; Aksi takdirde lütfen amplifikasyondan sonra boyut seçimini gerçekleştirin.

3. Ligasyon Güçlendirici, doğru boyut seçimi üzerinde önemli bir etkiye neden olabilecek yüksek konsantrasyonda PEG içerir. Bu nedenle, boyut seçimi adaptör ligasyonundan hemen sonra yapılacaksa, boyut seçiminden önce bir boncuk temizleme adımı eklenmesi şiddetle önerilir. Boyut seçimi adımı, uç onarımı/dA-kuyruklamadan önce veya sonra gerçekleştirilirse doğrudan gerçekleştirilebilir. kütüphane amplifikasyonu.

4. Manyetik boncuklar kullanılmadan önce oda sıcaklığında dengelenmelidir, aksi takdirde verim düşecek ve boyut seçme etkisi etkilenecektir.

5. Manyetik boncuklar kullanılmadan önce vorteks veya pipetleme yoluyla iyice karıştırılmalıdır.

6. Üstteki çözeltiyi aktarırken boncukları aspire etmeyin, boncukların eser miktarda bile olsa bulunması sonraki reaksiyonları etkileyebilir.

7. %80'lik etanolün taze hazırlanması gerekir, aksi takdirde geri kazanım verimi etkilenir.

8. Doğru boyut seçimi için 100 μL'den fazla bir hacimle başlanması önerilir. Daha az ise, hacmin ultra saf su ile 100 μL'ye çıkarılması önerilir.

9. Manyetik boncuklar, ürünü elüe etmeden önce oda sıcaklığında kurutulmalıdır. Yetersiz kuruluk, etanol kalıntısının sonraki reaksiyonları etkilemesine kolayca neden olur; aşırı kuruluk, manyetik boncukların çatlamasına ve saflaştırma veriminin azalmasına neden olur. Normalde, boncukların tamamen kuruması için oda sıcaklığında 3-5 dakika kurutmak yeterlidir.

10. Gerektiğinde, saflaştırılmış veya boyuta göre seçilmiş DNA örnekleri elüe edilir. 0,1× TE tamponu 4°C’de 1-2 hafta, -20°C’de ise 1 ay saklanabilir.

5. Kütüphane Amplifikasyonu

1. Kütüphane amplifikasyonunun yapılıp yapılmayacağı DNA girişinin miktarına, adaptörlerin tiplerine, dizileme verisi uygulamalarına vb. bağlıdır. Kısmi adaptörler kullanılıyorsa amplifikasyon adımı gereklidir. Tam uzunlukta adaptörler kullanıldığında, giriş DNA'sı < 200 ng ise amplifikasyon yapılması önerilir; aksi takdirde amplifikasyon gerekli değildir.

2. Amplifikasyon döngüsü sayıları sıkı bir şekilde kontrol edilmelidir. Yetersiz amplifikasyon düşük kütüphane verimine yol açabilir; Aşırı amplifikasyon artan önyargı, hatalar, tekrarlanan okuma ve kimerik ürünlere neden olabilir. Tablo 3 1 μg kütüphane verimini hedefleyen önerilen çevrim sayılarını listeler.

Masa 3 Üretilecek önerilen döngü sayısı 1.000 ng kütüphane verimi

Not

1.Tablo 3 yaklaşık 200 bp'lik yüksek kaliteli Giriş DNA testlerini kullanarak döngü parametrelerinin sayısını gösterir. FFPE DNA kalitesi büyük ölçüde değişir ve DNA kalitesi düşük olduğunda veya kütüphane uzunluğu uzun olduğunda, yeterli kütüphane elde etmek için döngü sayısının uygun şekilde artırılması gerekir.

2. Kütüphane oluşturma sürecinde boyut seçimi gerekiyorsa Kütüphane Amplifikasyonu için daha yüksek döngü sayısı önerilir; aksi takdirde daha düşük döngü sayısı önerilir.

3.Eksik adaptörler kullanılıyorsa, tam bir adaptör oluşturmak için en az 2 çevrimin yükseltilmesi gerekir.

6. Kütüphane Kalite Analizi

1. Oluşturulan kütüphanelerin kalitesi genellikle konsantrasyonların ve boyut dağılımlarının ölçülmesiyle analiz edilir.

2. Kütüphanelerdeki konsantrasyonlar Qubit ve PicoGreen gibi floresan tabanlı yöntemlerle veya qPCR ile ölçülebilir.

3. NanoDrop gibi absorbans bazlı kantifikasyon yöntemlerinin kullanılması önerilmez.

4. Kütüphane kantifikasyonu için qPCR yönteminin kullanılması önerilir: Qubit ve PicoGreen gibi floresan tabanlı yöntemler, eksik dsDNA yapılarını (adaptörsüz veya sadece bir ucu adaptörle bağlanmış ekler) tam kütüphanelerden ayırt edemez. qPCR yöntemi sadece her iki ucu adaptörlerle bağlanmış tam kütüphaneleri (sekanslanabilir kütüphaneler) çoğaltacak ve ölçecektir, böylece yükleme için daha doğru bir ölçüm sağlayacaktır.

5. Kütüphanelerin boyut dağılımı, Agilent Bioanalyzer veya kapiler elektroforez veya mikroakışkanlık prensiplerine dayanan diğer cihazlar kullanılarak analiz edilebilir.

7. Diğer Malzemeler

1. DNA saflaştırma manyetik boncukları: Hieff NGS^T.M. DNA Seçim Boncukları (Yeasen Cat#12601) veya AMPure^® XP Boncuk (A63880) veya diğer eşdeğer ürünler.

2.Adaptörler: Illumina için Tam Adaptör: Yeasen Cat#13519-13520; 384 Çift CDI Primerleri: Yeasen Kedi#12412~Kedi#12413; 384 Benzersiz Çift İndeks (UDI) Primerleri: Yeasen Kedi#12312~Kedi#12315; UMI UDI Adaptörleri: Yeasen Cat#13370~Cat#13371; MGI için Tam Adaptör: Yeasen Cat#13360-13362. DNA Primer Karışımı：Kedi#12190 veya Kedi#12191.

3. Kütüphane kalite analizi: Agilent 2100 Bioanalyzer DNA 1000 Çip/ Yüksek Hassasiyetli Çip veya diğer eşdeğer ürünler; kütüphane kantitatif reaktifleri.

4. Diğer malzemeler: mutlak etanol, steril ultra saf su, düşük tutulumlu pipet uçları, PCR tüpü, manyetik standlar, termal döngü cihazı, vb.

8. İş akışı

Şekil 1. İş akışı Bir tencere Profesyonel DNA Kütüphane Hazırlık Seti

Rakamlar

Farklı parçalanma koşulları altında elde edilen ek parçalarının boyutları

500 ng standart gDNA'yı şablon olarak kullanarak, bu kit ile kütüphaneler oluşturuldu. Parçalanma koşulları, sırasıyla 5, 10, 15, 20 ve 30 dakika boyunca 32°C, 35°C ve 37°C'de enzimatik sindirimdi. Parçalanmış ürünler 1,2x manyetik boncuklarla saflaştırıldı ve 21 μL ddH ile elüe edildi.₂O. Konsantrasyon Qubit kullanılarak ölçüldü ve kurtarılan insert parçalarının dağılımı aşağıdaki şekilde gösterilmektedir.

Şekil 2. Farklı enzim sindirim süreleri için 32°C'deki kütüphane profilleri

Şekil 3. Kütüphane profilleri farklı enzim sindirim süreleri için 35 °C'de

Şekil 4. Kütüphane profilleri farklı enzim sindirim süreleri için 37 °C'de