Hieff Superfast DNA Metilasyon Bisülfit Kiti (Kolon bazlı), DNA örneklerindeki metillenmemiş sitozinleri hızla urasile dönüştürürken, metillenmiş sitozinleri değişmeden bırakır. Yüksek sıcaklıkta bisülfit işlemi sırasında, çift sarmallı DNA tek sarmallara dönüşür. HSO3- varlığında, sitozin kalıntıları deaminasyona uğrar ve urasile dönüştürülürken, metillenmiş sitozinler değişmeden kalır. Sonraki PCR amplifikasyonunda, urasil timinle (T) değiştirilir. Dönüşüm süreci sadece 5 dakika sürer, 100 pg ile 2 μg arasında değişen DNA girdisini barındırır ve metillenmemiş sitozinler için ≥%99'luk bir dönüşüm verimliliği elde eder. Dönüştürülen DNA, PCR amplifikasyonu ve NGS dizilemesi gibi alt akış uygulamaları için uygundur.

Özellik

Düşük Giriş: 100 pg ile 2 μg arasındaki numunelerin dönüştürülmesi için uygundur

Kısa dönüşüm süresi: yaklaşık 5 dakika.

Minimum Örnek Hasarı: Dönüşüm sonrası iyi örnek bütünlüğünün korunması.

Yüksek Dönüşüm Verimliliği: Dönüşüm oranı ≥%99, Yüksek GC bölgelerinde düşük yanlış pozitif oranıyla yüksek dönüşüm oranları.

Nadir örnekler için uygundur, tek hücreli DNA metilasyon dönüşümü gibi.

RNA örneklerinin metilasyon dönüşümünü gerçekleştirebilir.

Ürün Bileşenler

Not:

Kutu başına 10 test için: Yıkama solüsyonuna 4,4 mL susuz etanol ekleyin.

Kutu başına 50 test için: Yıkama solüsyonuna 22 mL susuz etanol ekleyin.

Susuz etanolü ekledikten sonra ters çevirin ve iyice karıştırın, ardından gelecekte kullanmak üzere saklayın. Reaktif performansını etkileyebilecek etanol buharlaşmasını önlemek için şişe kapağının sıkıca kapatıldığından emin olun.

Figür

Şekil 4. İnsan genomik DNA örnekleri üzerindeki bisülfit dönüşümü hem 12225 hem de rakip Q dönüşüm kitleri kullanılarak gerçekleştirildi. Daha sonra, kütüphaneleri oluşturmak için metilasyona özgü tek zincirli DNA kütüphane hazırlama kitleri kullanıldı. Kütüphane verimi ve kalite kontrol verileri yukarıda sunulmuştur. Sonuçlar, hem 12225 hem de rakip Q kitlerinden birleştirilmiş kütüphaneleri dizilerken, 12225 kitinin daha yüksek veri çıktısı verdiğini, daha yüksek hedef oranına (%) ulaştığını ve daha düşük çoğaltma oranları (%) sergilediğini göstermektedir.

Nakliye ve Depolama

12225-A dönüşüm solüsyonunu oda sıcaklığında, ışıktan koruyarak saklayın. Diğer bileşenleri oda sıcaklığında saklayın. Raf ömrü 12 aydır.

Not:

1. Aşağı akış deneylerinin başarısını sağlamak için, dönüştürme adımı sırasında toplam giriş DNA miktarını doğru bir şekilde ölçün. DNA kantifikasyonu için Qubit 3.0/4.0 kullanılması önerilir, A260/A280 oranı 1,7 ile 1,9 arasındadır. Giriş DNA aralığı 100 pg ile 2 μg arasında olmalı, optimum aralık ise 100 ng ile 1 μg olmalıdır. Yetersiz DNA girişi aşağı akış tespitini engelleyebilirken, aşırı giriş kurtarma ve dönüştürme verimliliğini azaltabilir.

2. Dönüşüm solüsyonu, desülfonasyon solüsyonu ve yıkama solüsyonu uçucu bileşenler içerir. Kullanımdan sonra kapakları hemen sıkın ve oda sıcaklığında saklayın.

3. Dönüşüm sonrası örnekler için, hemen akış aşağısı deneylerine geçin. Kısa süreli depolama için -20°C'de, uzun süreli depolama için -80°C'de tutun.

4. Kendi güvenliğiniz ve sağlığınız için, çalışma sırasında laboratuvar önlüğü ve tek kullanımlık eldiven giyin.

5. Bu ürün yalnızca araştırma amaçlıdır!

Talimatlar

Reaktif ve sarf malzemelerinin hazırlanması: 1,5 mL steril santrifüj tüpü, enzimsiz su, mutlak etanol, PCR tüpü;

ben Bisülfit dönüşümü:

1) Test edilecek numune sayısına göre uygun steril PCR tüpünü hazırlayın ve reaksiyon sistemini aşağıdaki tabloya göre hazırlayın:

2) Dönüşüm sistemi

Yukarıdaki sistemi bir pipet yardımıyla üfleyip karıştırın veya vorteksleyin ve 5 saniye karıştırın, ardından kısa bir süre santrifüjleyin ve reaksiyon çözeltisini PCR tüpünün dibine kadar santrifüjleyin.

v Not: 1. Bu sırada PCR tüpündeki reaksiyon solüsyonunun toplam hacmi 200 μL'dir. Dönüşümü daha eksiksiz hale getirmek için, reaksiyon solüsyonu eşit parçalara bölünmeli ve 2. adımda üfleme ve karıştırma işleminden sonra yeni bir steril PCR tüpüne aktarılmalı ve dönüşüm prosedürü çalıştırılmalıdır. Dönüşümden sonra, iki PCR tüpündeki reaksiyon solüsyonları saflaştırma için aynı saflaştırma kolonunda birleştirildi.

2. Örnek hacmi 20 ile 40 μL arasında ise, toplam hacmi 200 μL'ye ulaşacak şekilde dönüşüm çözeltisinin hacmini azaltın.

3. Örnek hacmi 50 μL ise 150 μL dönüşüm çözeltisi eklenir, toplam hacim 200 μL’de tutulur ve dönüşüm süresi 6-10 dakikaya uzatılır.

3) CT dönüşüm programının ayarlanması

PCR tüpü, reaksiyonun gerçekleştirilmesi için önceden programlanmış bir PCR cihazına yerleştirilir.

ben Arınma

1) T200 μL'lik bir miktar aktarın dönüşüm çözüm Parıtma sütunuS, 30-60 saniye santrifüj 13000 G, süzüntüyü atın ve arıtma sütununu Ckolleksiyon tüpüS Tekrar;

2) 100 μL ekleyin Yıkama Tamponu içine Arıtma Kolonları (mutlak etanol eklendiğini doğrulayın), 30-60 saniye santrifüjleyin 13000 G, süzüntüyü atın ve arıtma sütununu Ckolleksiyon tüpüS Tekrar;

3) 200 μL ekleyin Desülfonasyon Tamponu içine Arıtma Kolonları ve reaksiyonun oda sıcaklığında 20 dakika beklemesine izin verin. Reaksiyondan sonra 30-60 saniye santrifüjleyin 13000 G, süzüntüyü atın ve Arıtma Kolonları içinde Ckolleksiyon tüpüS Tekrar;

4) 200 μL ekleyin Yıkama Tamponu için Arıtma Kolonları, 30-60 saniye santrifüj 13000 G süzüntüyü atın ve Parıtma sütunuS içinde Ckolleksiyon tüpüS Tekrar;

5) 4. adımı bir kez tekrarlayın;

6) Aktar Arıtma Kolonları Hazırlanan 1,5 mL santrifüj tüpüne 10-30 μL ekleyin Elüsyon tamponu Kapağı açıp kuruttuktan sonra filtre membranının ortasına toplayın ve DNA Oda sıcaklığında 1 dakika bekletildikten ve 13000 derecede 1 dakika santrifüj edildikten sonra G;

7) Sakla DNA geçici olarak -20 ℃'de saklayın. Uzun süreli depolama için lütfen DNA -80 ℃'de saklayın ve gereksiz yere tekrar tekrar dondurma ve çözme işlemlerinden kaçının.

Not: Saflaştırılmış dönüşüm ürünü, daha sonraki PCR reaksiyonunda veya dizileme sürecinde doğrudan kullanılabilir.

Manuel