Hieff NGS® DNA&RNA Kütüphanesi Ortak Hazırlık Kiti V2 Illumina®&MGI® dizileme platformu için bir DNA&RNA eş-kütüphane kitidir ve verimli cDNA sentez reaktifi ve enzim sindirim reaktifi içerir. Geleneksel kütüphane ile karşılaştırıldığında yapı Bu yöntemle, bu ürün cDNA sentezini ve DNA&RNA kütüphanesini verimli bir şekilde tamamlayabilir yapı tek tüpte. Kit, DNA parçalanması için yüksek kaliteli enzim içerir ve DNA parçalanması, uç onarımı ve dA kuyruğunu tek bir adımda birleştirir, bu da kütüphane hazırlama süresini ve maliyetini önemli ölçüde azaltır. Bu kütüphane hazırlama kiti mükemmel bir kütüphane dönüşüm oranına sahiptir ve tüm yaygın hayvanlar, bitkiler, mikroorganizmalar vb.'den alınan örnekler ve ayrıca FFPE örnekleri için geçerlidir. En son optimize edilmiş ligazı kullanan bu yükseltilmiş kit, adaptör ligasyonu sırasında kendi kendine ligasyon oranını büyük ölçüde azaltır. Dahası, yeni bir yüksek doğruluklu polimerazın tanıtımı, amplifikasyonun homojenliğini ve doğruluğunu daha da artırır.

Kitte bulunan tüm bileşenler sıkı kalite kontrol ve işlevsel doğrulamadan geçmiştir; bu da kütüphane yapısının kararlılığını ve tekrarlanabilirliğini en üst düzeyde garanti eder.

Özellikler

Bileşenler

Not: * bu reaktifin bu kitte bulunmadığını ve ek reaktiflerin gerekli olduğunu gösterir. Kit dır çift ​​platformlarla uyumlu Aydınlanma^®&MGI^®, ancak ek astar karışımı (CAT # 13334 MGI için Astar Karışımı)^® ve Cat# 13335 Illumina için Primer Karışımı^®) gereklidir.

İş akışı:

Depolamak

Bu ürün -25~-15℃'de saklanmalıdır. 1 yıl.

Notlar

Operasyon hakkında

1. 1. Lütfen kendi güvenliğiniz için laboratuvar önlüğü ve tek kullanımlık eldivenlerle çalışın.
2. Bileşenleri oda sıcaklığında çözdürün.Çözüldükten sonra vorteksleyerek iyice karıştırın, tüpleri kısa bir süre döndürün ve daha sonra kullanmak üzere buz üzerine koyun.
3. Her reaksiyon adımının ısıtılmış kapaklı bir termosiklörde gerçekleştirilmesi önerilir. Termosiklör kullanımdan önce ayarlanan sıcaklığa önceden ısıtılmalıdır.
4. Lütfen RNase içermeyen sarf malzemeleri kullanınkirlenme ve deney alanının temizlenmesi düzenli olarak. ThermoFisher'ın RNAZap'ı^T.M. RNase kontaminasyonunu gidermek için yüksek verimli nükleik asit giderme spreyi önerildi.
5. Uygunsuz işlemler büyük olasılıkla aerosol kontaminasyonuna neden olabilir ve bu da sonucun doğruluğunu etkileyebilir.PCR reaksiyon karıştırma bölgelerinin ve PCR ürünü saflaştırma deneyi bölgelerinin zorunlu fiziksel izolasyonu önerilir. Kütüphane yapımı için özel pipetler gibi ekipmanlarla donatılmıştır.
6. 6. Bu ürün yalnızca araştırma amaçlıdır.

Adaptör Ligasyonu

1. Müşterilerin deneysel gereksinimlerine göre seçebilecekleri Illumina veya MGI Uzun Adaptör (Barkodlu Adaptör) kitleri ve kısa Adaptör kitleri mevcuttur.
2. Yüksek kaliteli, ticari adaptörlerin seçilmesi önerildi. Kendi kendine yapılan adaptörler seçilirse, lütfen NGS primer sentezinde deneyimli bir şirkete güvenin ve sıkı kontaminasyon kontrolüne ihtiyaç olduğunu belirtin. Ayrıca, çapraz kontaminasyonu önlemek için DNA tavlama solüsyonunun temiz bir tezgahta hazırlanması ve her seferinde yalnızca bir adaptör türü çalıştırılması önerilir.
3. Lütfen adaptörleri buz üzerinde veya 4°C'de çözdürün; oda sıcaklığında çalıştırıldığında adaptörlerin denatüre olmasını önlemek için laboratuvar sıcaklığı 25°C'yi geçmemelidir.
4. Adaptörün konsantrasyonu, ligasyon verimliliğini ve kütüphane verimini doğrudan etkiler. Kite eklenen adaptör hacmi 5 μl olarak sabitlenir. Adaptörlerin 0,1×TE tamponuyla seyreltilmesi önerilir ve seyreltilmiş adaptörler 4°C'de 48 saat saklanabilir. Tablo1 Farklı miktarlardaki giriş RNA'sı için önerilen adaptör miktarını listeler.

Tablo 1-1 Önerilen Illumina^® farklı giriş için adaptör miktarı DNA ve RNA

Tablo 1-2 Önerilen MGI^® farklı giriş için adaptör miktarı DNA ve RNA

*Adaptör kullanımı farklı Toplam RNA numunesi tiplerine ve giriş miktarına göre ayarlanabilir.

Kütüphane Amplifikasyonu

Amplifikasyon döngüsü sayıları sıkı bir şekilde kontrol edilmelidir. Yetersiz amplifikasyon düşük kütüphane verimine yol açabilir; Aşırı amplifikasyon artan önyargı, hatalar, tekrarlanan okuma ve kimerik ürünlere neden olabilir. Tablo 2 1 μg kütüphane verimini hedefleyen önerilen çevrim sayılarını listeler.

Masa 2 DNA&RNA kütüphanesini oluşturmak için önerilen döngü sayısı *

Not: *Kütüphanenin verimi yalnızca giriş miktarı ve amplifikasyon çevrimi sayısıyla ilgili değildir, aynı zamanda örneklerin kalitesi, parçalanma koşulları ve sıralama koşullarından da etkilenir. Kütüphane oluşturma sürecinde, gerçek duruma göre en uygun koşulları seçin.

Boncuk Tabanlı DNA Temizliği ve Boyut Seçimi

1. 1. DNA saflaştırma manyetik boncukları gerektiren kütüphane oluşturma sürecinde birden fazla adım vardır. DNA saflaştırma ve boyut seçimi için Hieff NGS™ DNA Seçim Boncuklarını (Yeasen Cat#12601) veya AMPure® XP manyetik boncuklarını (Beckman Cat#A63880) öneriyoruz.
2. 2.Manyetik boncuklar kullanılmadan önce oda sıcaklığında dengelenmelidir, aksi takdirde verim düşecek ve boyut seçme etkisi etkilenecektir.
3. 3.Manyetik boncuklar kullanılmadan önce vorteks veya pipetleme yoluyla iyice karıştırılmalıdır.
4. 4.Üst fazı aktarırken boncukları aspire etmeyin, boncukların eser miktarda bile olsa bulunması sonraki reaksiyonları etkileyebilir.
5. 5. %80’lik etanol taze olarak hazırlanmalıdır, aksi takdirde geri kazanım verimi etkilenecektir.
6. 6. Manyetik boncuklar, ürünü elüe etmeden önce oda sıcaklığında kurutulmalıdır. Yetersiz kuruluk, etanol kalıntısının sonraki reaksiyonları etkilemesine kolayca neden olur; aşırı kuruluk, manyetik boncukların çatlamasına ve saflaştırma veriminin azalmasına neden olur. Normalde, boncukların tamamen kuruması için oda sıcaklığında 3-5 dakika kurutmak yeterlidir.
7. 7.Gerektiğinde, saflaştırılmış veya boyuta göre seçilmiş DNA örnekleri elüe edilir.1× TE tamponu 4°C’de 1-2 hafta, -20°C’de ise 1 ay saklanabilir.

Kütüphane Kalite Analizi

1. Oluşturulan kütüphanelerin kalitesi genellikle konsantrasyonların ve boyut dağılımlarının ölçülmesiyle analiz edilir.
2. Kütüphanelerdeki konsantrasyonlar Qubit ve PicoGreen gibi floresan tabanlı yöntemlerle veya qPCR ile ölçülebilir.
3. NanoDrop gibi absorbans bazlı kantifikasyon yöntemlerinin kullanılması ÖNERİLMEZ.
4. Kütüphane kantifikasyonu için qPCR yönteminin kullanılması önerilir: Qubit ve PicoGreen gibi floresan tabanlı yöntemler, eksik dsDNA yapılarını (adaptörsüz veya sadece bir ucu adaptörle bağlanmış ekler) tam kütüphanelerden ayırt edemez. qPCR yöntemi sadece her iki ucu adaptörlerle bağlanmış tam kütüphaneleri (sekanslanabilir kütüphaneler) çoğaltacak ve ölçecektir, böylece yükleme için daha doğru bir ölçüm sağlayacaktır.
5. Kütüphanelerin boyut dağılımları Agilent Bioanalyzer veya kapiler elektroforez veya mikroakışkanlık prensiplerine dayanan diğer cihazlar kullanılarak analiz edilebilir.

Diğer Malzemeler

1. 1.DNA saflaştırma manyetik boncukları: Hieff NGS™ DNA Seçim Boncukları (Yeasen Cat#12601) veya AMPure^®XP Boncuk (A63880) veya diğer eşdeğer ürünler.

2.Adaptörler: Illumina için Tam Adaptör (Yeasen Cat#13519-13520 veya diğer eşdeğer ürünler) veya MGI için Tam Adaptör (Yeasen Cat#13360-13362 veya diğer eşdeğer ürünler).

3. Kütüphane kalite analizi: Agilent 2100 Bioanalyzer DNA 1000 Çip/ Yüksek Hassasiyetli Çip veya diğer eşdeğer ürünler; kütüphane kantitatif reaktifleri.
4. Diğer malzemeler: mutlak etanol, steril ultra saf su, düşük tutulumlu pipet uçları, PCR tüpü, manyetik standlar, termal döngü cihazı, vb.

Belgeler:

Kılavuzlar

12305ES-Hieff NGS® DNA&RNA Kütüphanesi Eş Hazırlık Kiti V2.pdf