Tanım
Ürün Açıklaması
Hieff NGS™ Ultima Dual-mode RNA Library Prep Kit, RNA parçalanma reaktifleri, ters transkripsiyon reaktifleri, geleneksel ve zincire özgü ds-cDNA sentez reaktifleri ve kütüphane amplifikasyon reaktifleri dahil olmak üzere Illumina® ve MGI® dizileme platformu için tam bir RNA dizileme kütüphanesi oluşturma kitidir. Dizileme kütüphanesi, mRNA saflaştırma kiti veya rRNA çıkarma kiti tarafından takip edilebilir. İki zincirli sentez modülü, geleneksel bir kütüphane veya zincire özgü kütüphane ihtiyacını karşılamak için iki tamponla donatılmıştır. Bunlar arasında, zincire özgü iki zincirli sentez tamponunda dTTP, dUTP ile değiştirilir, böylece dUTP, cDNA'nın ikinci zincirine eklenebilir. Bu kitte kullanılan yüksek doğruluklu DNA polimeraz, urasil içeren DNA şablonunu çoğaltamaz ve zincir özgüllüğü elde eder. Sağlanan tüm reaktifler sıkı kalite kontrol ve işlevsel doğrulamadan geçmiş olup, kütüphane yapısının kararlılığı ve tekrarlanabilirliği en üst düzeyde garanti altına alınmıştır.
İş akışı
Ürün Bileşenleri
| Bileşenler | 12308ES24 | 12308ES96 | |||
| 12308-A | 2× Frag/Prime Tamponu | 250 μL | 930 μL | ||
| 12308-B | 1. Zincir Enzim Karışımı | 48 μL | 192 μL | ||
| 12308-C | Tel Spesifitesi Reaktifi | 150 μL | 580 μL | ||
| 12308-D | 2. Zincir Tamponu (dNTP) | 720 μL | 2×1440 μL | ||
| 12308-D | 2. Zincir Tamponu (dUTP) | 720 μL | 2×1440 μL | ||
| 12308-F | 2. Zincir Enzim Master Karışımı | 120 μL | 480 μL | ||
| 12308-G | Ligasyon Güçlendirici | 720 μL | 2×1440 μL | ||
| 12308-H | Yeni T4 DNA Ligazı | 120 μL | 480 μL | ||
| 12308-Ben | 2×Süper Canace® II Yüksek Sadakat Karışımı | 600 μL | 2×1200 μL | ||
| 12308-K | Nükleaz Serbest H2O | 300 μL | 1000 μL | ||
Not: Bu kit hem Illumina hem de MGI platformlarıyla uyumludur, ancak ek Illumina veya MGI Primer Karışımı (Kat# 13335 Illumina için Primer Karışımı) ve Cat# 13334 MGI için Primer Karışımı ) dır gerekli.
Nakliye ve Depolama
Kutu I'deki Hieff NGS™ Ultima Dual-mode mRNA Kütüphane Hazırlık Kiti bileşenleri buz paketleriyle birlikte gönderilir ve 2-8°C'de bir yıl saklanabilir.
Kutu II'deki Hieff NGS™ Ultima Dual-mode mRNA Kütüphane Hazırlık Kiti bileşenleri kuru buzla birlikte gönderilir ve -20°C'de bir yıl boyunca saklanabilir.
Dikkat Edilmesi Gerekenler
1 İşlem
1.1 Güvenliğiniz ve sağlığınız için, bu ürünle çalışırken lütfen laboratuvar önlükleri ve tek kullanımlık eldivenler gibi kişisel koruyucu ekipman (PPE) giyin. Bu ürün SADECE araştırma amaçlıdır!
1.2 Bileşenleri oda sıcaklığında çözün. Birkaç kez ters çevirerek iyice karıştırın, kısa bir süre döndürün ve kullanım için buz üzerine koyun.
1.3 Her adım reaksiyonunun ısıtılmış kapaklı bir termal döngü cihazında gerçekleştirilmesi önerilir. Termal döngü cihazı kullanımdan önce ayarlanan sıcaklığa önceden ısıtılmalıdır.
1.4 RNase kontaminasyonundan ari malzemelerin kullanılması ve deney alanının düzenli olarak temizlenmesi gerekmektedir.
1.5 Uygunsuz işlemler büyük olasılıkla aerosol kontaminasyonlarına neden olarak sonucun doğruluğunu etkileyebilir. PCR reaksiyon karıştırma bölgelerinin ve PCR ürünü saflaştırma testi bölgelerinin zorunlu fiziksel izolasyonu önerilir. Kütüphane yapımı için özel pipetler gibi ekipmanlarla donatılmıştır.
2 Adaptör Ligasyonu
2.1 Illumina veya MGI Uzun Adaptör (Barkodlu Adaptör) kitleri ve kısa Adaptör kitleri, müşterilerin deneysel gereksinimlerine göre seçebilecekleri şekilde mevcuttur.
2.2 Yüksek kaliteli, ticari adaptörlerin seçilmesi önerildi. Kendiniz yaptığınız adaptörler seçilirse, lütfen NGS primer sentezinde deneyimli bir şirkete güvenin ve sıkı kontaminasyon kontrolüne ihtiyaç duyduğunuzu belirtin. Ayrıca, çapraz kontaminasyonu önlemek için DNA tavlama solüsyonunu temiz bir tezgahta hazırlamanız ve her seferinde yalnızca bir adaptör türü çalıştırmanız önerilir.
2.3 Adaptörleri buz üzerinde veya 4°C'de çözdürün; oda sıcaklığında çalıştırıldığında adaptörlerin denatüre olmasını önlemek için laboratuvar sıcaklığı 25°C'yi geçmemelidir.
2.4 Adaptörün konsantrasyonu, ligasyon etkinliğini ve kütüphane verimini doğrudan etkiler. Kite eklenen adaptör hacmi 5 μl olarak sabitlenir. Adaptörlerin 0,1×TE tamponuyla seyreltilmesi önerilir ve seyreltilmiş adaptörler 4°C'de 48 saat saklanabilir. Tablo 1'de farklı miktarlardaki giriş RNA'sı için önerilen adaptör miktarı listelenmiştir.
Tablo 1-1 Farklı giriş RNA'ları için önerilen Illumina adaptör miktarı
| Giriş Toplam RNA | Aydınlanma Adaptör stok konsantrasyonu |
| 10 ng | 1 μM |
| 100 ng | 1,5 μM |
| 500 ng | 3 μM |
| ≥1 μg | 5 μM |
Tablo 1-2 Farklı giriş RNA'ları için önerilen MGI® adaptör miktarı
| Giriş Toplam RNA | MGI Adaptör stok konsantrasyonu |
| 100-499 ng | 2 μM |
| 500-4000 ng | 5 μM |
*Adaptör kullanımı farklı Toplam RNA numunesi tiplerine ve giriş miktarına göre ayarlanabilir.
3 Kütüphane Amplifikasyonu
3.1 Birinci nesil DNA polimeraz temelinde, kitte bulunan yüksek kaliteli DNA polimeraz, amplifikasyon düzgünlüğünü büyük ölçüde iyileştirmiştir ve hiçbir amplifikasyon önyargısı göstermemektedir.
3.2 Hedef DNA'ya Endeksli Adaptör (uzun adaptör veya büyük Y adaptörü olarak da bilinir) bağlanırsa, bu kitte sağlanan primer karışımı amplifikasyon için kullanılabilir; DNA bağlanması için "kısa adaptör" veya "küçük Y adaptörü" kullanılırsa, amplifikasyon için indeks primerlerine ihtiyaç duyulur.
3.3 Amplifikasyon döngüsü sayıları sıkı bir şekilde kontrol edilmelidir. Yetersiz amplifikasyon düşük kütüphane verimine yol açabilir; Aşırı amplifikasyon artan önyargı, hatalar, tekrarlanan okuma, kimerik ürünler ve genişleme mutasyonlarının birikmesine neden olabilir. Tablo 2, PCR amplifikasyonu için önerilen döngü sayılarını listeler.
Tablo 2 RNA kütüphanesi oluşturmak için önerilen döngü sayısı*
| Giriş Toplam RNA | Döngü sayısı | |
| Karaya oturmamış | Mahsur kalmış | |
| 10 ng | 15 | 15 |
| 100 ng | 14 | 14 |
| 500 ng | 12 | 13 |
| 1 mikrogram | 11 | 12 |
Not: *Kütüphanenin verimi yalnızca giriş miktarı ve amplifikasyon döngülerinin sayısıyla ilişkili değildir ancak örneklerin kalitesinden, parçalanma koşullarından ve sıralama koşullarından da etkilenir. Kütüphane oluşturma sürecinde, gerçek duruma göre en uygun koşulları seçin.
4 Boncuk Bazlı DNA Temizliği ve Boyut Seçimi
4.1 DNA saflaştırma manyetik boncukları gerektiren kütüphane oluşturma sürecinde birden fazla adım vardır. DNA saflaştırma ve boyut seçimi için Hieff NGS™ DNA Seçim Boncuklarını (Yeasen Cat#12601) veya AMPure® XP manyetik boncuklarını (Beckman Cat#A63880) öneriyoruz.
4.2 Manyetik boncuklar kullanılmadan önce oda sıcaklığında dengelenmelidir, aksi takdirde verim düşecek ve boyut seçme etkisi etkilenecektir.
4.3 Manyetik boncuklar kullanılmadan önce vorteks veya pipetleme yoluyla iyice karıştırılmalıdır.
4.4 Üstteki çözeltiyi aktarırken boncukları aspire etmeyin, boncukların eser miktarda bile olsa bulunması aşağıdaki reaksiyonları etkileyebilir.
4.5 %80’lik etanol taze olarak hazırlanmalıdır, aksi takdirde geri kazanım verimi etkilenir.
4.6 Manyetik boncuklar, ürün elüsyona uğratılmadan önce oda sıcaklığında kurutulmalıdır. Yetersiz kuruluk, etanol kalıntısının sonraki reaksiyonları etkilemesine kolayca neden olur; aşırı kuruluk, manyetik boncukların çatlamasına ve saflaştırma veriminin azalmasına neden olur. Normalde, boncukların tamamen kuruması için oda sıcaklığında 3-5 dakika kurutma yeterlidir.
4.7 Gerektiğinde TE tamponunda elüe edilen saflaştırılmış veya boyut seçilmiş DNA örnekleri 4°C’de 1-2 hafta veya -20°C’de 1 ay saklanabilir.
5 Kütüphane Kalite Analizi
5.1 Normalde, oluşturulan kütüphanenin kalitesi uzunluk dağılımı ve konsantrasyon tespiti ile değerlendirilebilir.
5.2 Kütüphane konsantrasyon tespiti: Qubit®, PicoGreen® vb. çift sarmallı DNA floresan boyalarına dayalı yöntemler; qPCR'ye dayalı mutlak kantifikasyon.
5.3 NanoDrop® vb. spektral tespite dayalı yöntemler kütüphane konsantrasyon tespitinde uygulanamaz.
5.4 qPCR, kütüphane konsantrasyonu tespiti için önerilir: Qubit®, PicoGreen® ve çift sarmallı DNA floresan boyalarına dayalı diğer yöntemler aracılığıyla, bir uçtan adaptörlere bağlanan ürünler, her iki uçtan adaptörlere bağlanmayan ürünler ve diğer eksik çift sarmallı ürünler arasında etkili bir şekilde ayrım yapamaz. qPCR'nin mutlak kantifikasyonu, yalnızca numunenin her iki ucundaki adaptörün tam kütüphanesini (dizilenebilen kütüphane) kantifize eden ve adaptöre tek uçlu veya çift uçlu uçlardan bağlanmamış dizilemeyen kütüphanelerin girişimini hariç tutan PCR amplifikasyonu ilkesine dayanır.
5.5 Kütüphane uzunluk dağılımı tespiti, Agilent Bioanalyzer 2100 ve kapiler elektroforez veya mikroakışkanlık prensibine dayanan diğer ekipmanlarla gerçekleştirilebilir.
Belgeler:
12308ES-Hieff NGS™ Ultima Çift Modlu RNA Kütüphane Hazırlık Kiti-Ver.EN20230327.pdf
Alıntılar ve Referanslar:
[1] Çoklu omik yaklaşımıyla sazan balığının bağırsak mikrobiyomunun şifresinin çözülmesi
M Li, H Liang, H Yang, Q Ding, R Xia, J Chen, W Zhou… - Mikrobiyom, 2024 IF:19.4
[2] Birleştirilmiş CRISPR Taraması, P-Cisimciklerini Kanser Epitel-Mezenkimal Geçişinin Baskılayıcıları Olarak Belirler
L Fang, L Zhang, M Wang, Y He, J Yang, Z Huang… - Kanser Araştırması, 2024 IF:12.7
[3] Klotho türevi peptid 1, transkripsiyon sonrası düzenleme yoluyla Klotho ekspresyonunu geri kazandırarak fibrotik böbrekte hücresel yaşlanmayı engeller
X Zhang, L Li, H Tan, X Hong, Q Yuan, FF Hou… - Teranostik, 2024 IF:12.4
[4] İnfarktüslü Miyokardın Onarılması İçin Dış İskelet Kısmi Kaplamalı Kök Hücreler
H He, Y Yuan, Y Wu, J Lu, X Yang, K Lu… - Gelişmiş Malzemeler, 2023 IF: 29,4
[5] Pamuk cinsi Gossypium'un evrimi sırasında genomik yenilik ve düzenleyici yeniden yapılandırma
M Wang, J Li, Z Qi, Y Long, L Pei, X Huang… - Doğa Genetiği, 2022 IF:41.379
[6] MTMR3 risk alelleri, IgA nefropatisinde Toll Benzeri Reseptör 9 kaynaklı IgA bağışıklığını artırır
Y Wang, T Gan, S Qu, L Xu, Y Hu, L Liu, S Shi, J Lv… - Böbrek Uluslararası, 2023 IF:19.6
[7] Hedef dışı düzenlemeleri en aza indirmek için temel düzenleyicilerin bölünmüş tamamlayıcılığı
X Xiong, K Liu, Z Li, FN Xia, XM Ruan, X He, JF Li - Doğa Bitkileri, 2023 IF:18.6
[8] Onkolitik adenovirüsleri kapsülleyen tasarlanmış bakteriyel dış zar kesecikleri, tümör hücresi otofajisini artırarak kanser viroterapisinin etkinliğini artırır
W Ban, M Sun, H Huang, W Huang, S Pan… - Nature Communications, 2023 IF:16.6
[9] Kanser Hücrelerinin IFNγ'ye Direnci, Geliştirilmiş Çift Zincirli Kırılma Onarım Yolu Aktivitesi Yoluyla Gerçekleşebilir
T Han, X Wang, S Shi, W Zhang, J Wang, Q Wu… - Kanser İmmünoloji Araştırması, 2023 IF: 12.0
[10] Hepatosit karsinomu'nda sisplatin direncinin üstesinden gelmek için çift hedefli biyomimetik nano-teslim sistemine dayalı kombinasyon tedavisi
Y Huang, Q Kou, Y Su, L Lu, X Li, H Jiang… - Nanobiyoteknoloji Dergisi, 2023 IF: 10.9
[11] PIAS3, hepatosellüler karsinomda TGF-β sinyal yolu aracılığıyla TXNIP'yi düzenleyerek ferroptozu teşvik eder
W Bao, J Wang, K Fan, Y Gao, J Chen - Farmakolojik Araştırma, 2023 IF:9.3
[12] Saccharomyces cerevisiae'de HyperTRIBE ile RNA Bağlayıcı Protein Hedeflerinin Belirlenmesi
W Piao, C Li, P Sun, M Yang, Y Ding, W Song… - Uluslararası Moleküler Bilim Dergisi, 2023 IF:5.6
[13] Mikrobiyota, denizanasında yaşam döngüsü geçişini ve nematosit dinamiklerini düzenler
S Peng, L Ye, Y Li, F Wang, T Sun, L Wang, W Hao… - Iscience, 2023 IF: 5.08
[14] Transkriptom ve miRNA Profilleri, “84K” Kavakta İkincil Ksilem Oluşumunun Düzenleyici Ağını ve Temel Düzenleyicilerini Ortaya Çıkarıyor
H Wang, P Zhao, Y He, Y Su, X Zhou… - Uluslararası Moleküler Bilim Dergisi, 2023 IF:5.6
Ödeme ve Güvenlik
Ödeme bilgileriniz güvenli bir şekilde işlenir. Kredi kartı ayrıntılarını saklamıyoruz veya kredi kartı bilgilerinize erişimimiz yok.
Sorgu
Ayrıca sevebilirsiniz
SSS
Ürün yalnızca araştırma amaçlıdır ve insanlarda veya hayvanlarda terapötik veya teşhis amaçlı kullanım için tasarlanmamıştır. Ürünler ve içerikler, Yeasen Biotechnology'nin sahip olduğu patentler, ticari markalar ve telif haklarıyla korunmaktadır. Ticari marka sembolleri, tüm bölgelerde tescilli olmayıp, menşe ülkesini gösterir.
Bazı uygulamalar üçüncü tarafların ek fikri mülkiyet haklarına ihtiyaç duyabilir.
Yeasen, araştırmalarımızın güvenlik ve etik standartları sağlarken kritik soruları ele alması gerektiğine inanarak etik bilime kendini adamıştır.