Yüksek NGS^T.M. EvoMax RNA Kütüphane Hazırlık Kiti (dUTP) bir önceden karıştırılmış, aktinomisin D ücretsiz ve iplik-özgü toplam RNA dizileme kütüphanesi hazırlık Illumina ve MGI platformlarıyla uyumlu kit. Bu ürün iki tipte mevcuttur: tüp veya sızdırmazlık kiti ve bu kit daha fazlası uygun Otomatik Sıvı İşleme Cihazı ile olsun veya manuel manipülasyon Kit, RNA parçalanma reaktifleri, ters transkripsiyon reaktifleri, zincir-spesifik ds-cDNA sentez reaktifleri ve kütüphane amplifikasyon reaktiflerini içerir. mRNA saflaştırma kiti veya rRNA çıkarma kiti ile bağlantılı olabilir. mRNA veya lncRNA araştırması yapın. Bu ürün, deneycilerin güvenliğini daha büyük ölçüde garanti eden aktinomisin D olmadan yüksek zincir özgüllüğüne sahip bir kütüphane elde etmek için ters transkripsiyon modülünü optimize eder. Tüm reaktifler, kütüphanenin kararlılığını ve tekrarlanabilirliğini en üst düzeye çıkarmak için sıkı kalite kontrolüne ve işlevsel doğrulamaya tabi tutulmuştur hazırlık.

Özellikler

Bileşenler

Not: * Notasyon, bileşenin sete dahil olmadığını gösterir. Tam adaptörler kullanılırsa astar karışımı gereklidir, aksi takdirde't. Bu kit Illumina ve MGI platformlarıyla uyumludur, ancak ek astar karışımına ihtiyaç duyar (Cat # 13334 MGI için Astar Karışımı)^T.M. ve Illumina® veya MGI platformu için Cat # 13335 Primer Karışımı (tam adaptörler kullanılıyorsa)

Figür

Plaka reaktif grubunun düzeni.

Şekil 1: Sızdırmazlık plakası kütüphane kitinin reaktif düzeni

Şekil 2. Basitleştirilmiş bileşenler EvoMax RNA Kütüphane Hazırlık Kiti.

Depolamak

Bu ürün -25~-15℃'de saklanmalıdır. 1 Yıllar.

Talimatlar

1. 20 μL'lik bir sisteme eklenmesi önerilen miktar: 0,1-1 birimler (U), ve giriş miktarı gerçek sonuçlara göre ayarlanabilir.

2. Deneyin gereklerine göre, dUTP’nin son konsantrasyonu 0,2~0,6 mM arasında ayarlanabilir ve seçici olarak 0,2 mM dTTP eklenebilir.

3. 25~37℃'de tepki süresi Deneysel gereksinimlere göre 5~10 dakika içerisinde ayarlanabilir.

Notlar

1. Operasyon

1) Lütfen laboratuvar önlükleri ve tek kullanımlık eldivenlerle çalışın.，güvenliğiniz için.

2) Bileşenleri oda sıcaklığında çözün. Birkaç kez yukarı aşağı çevirerek iyice karıştırın, kısa bir süre döndürün ve kullanım için buz üzerine koyun.

3) Her adım reaksiyonunun ısıtılmış kapaklı bir termal döngü cihazında gerçekleştirilmesi önerilir. Termal döngü cihazı kullanımdan önce ayarlanan sıcaklığa önceden ısıtılmalıdır.

4) RNase kontaminasyonundan arındırılmış malzemeler ve deney alanının düzenli olarak temizlenmesi gereklidir. ThermoFisher'ın RNAZap'ı^T.M. RNase kontaminasyonunu gidermek için yüksek verimli nükleik asit giderme spreyi önerildi.

5) Uygunsuz işlemler büyük olasılıkla aerosol kontaminasyonlarına neden olarak sonucun doğruluğunu etkileyebilir. PCR reaksiyon karıştırma bölgelerinin ve PCR ürünü saflaştırma testi bölgelerinin zorunlu fiziksel izolasyonu önerilir. Kütüphane yapımına yönelik özel pipetler gibi ekipmanlarla donatılmıştır.

6) Bu reaktif tek kullanımlıktır. Birden fazla kullanımı kesinlikle yasaktır.

7) Bu ürün yalnızca araştırma amaçlıdır.

2. Adaptör Ligasyonu

1) Müşterilerin deneysel gereksinimlerine göre seçebilecekleri Illumina veya MGI Uzun Adaptör (Barkodlu Adaptör) kitleri ve kısa Adaptör kitleri mevcuttur.

2) Yüksek kaliteli, ticari adaptörlerin seçilmesi önerildi. Kendi kendine yapılan adaptörler seçilirse, lütfen NGS primer sentezinde deneyimli bir şirkete güvenin ve sıkı kontaminasyon kontrolüne ihtiyaç olduğunu belirtin. Ayrıca, çapraz kontaminasyonu önlemek için DNA tavlama solüsyonunun temiz bir tezgahta hazırlanması ve her seferinde yalnızca bir adaptör türü çalıştırılması önerilir.

3) Lütfen adaptörleri buz üzerinde veya 4°C'de çözdürün; oda sıcaklığında çalıştırıldığında adaptörlerin denatüre olmasını önlemek için laboratuvar sıcaklığı 25°C'yi geçmemelidir.

4) Adaptörün konsantrasyonu, ligasyon verimliliğini ve kütüphane verimini doğrudan etkiler. Kite eklenen adaptör hacmi 5 μl olarak sabitlenir. Adaptörlerin 0,1×TE tamponuyla seyreltilmesi önerilir ve seyreltilmiş adaptörler 4°C'de 48 saat saklanabilir. Tablo 1 Farklı miktarlardaki giriş RNA'sı için önerilen adaptör miktarını listeler.

Tablo 1-1 Farklı giriş RNA'ları için önerilen Illumina adaptör miktarı

Tablo 1-2 Farklı giriş RNA'ları için önerilen MGI adaptör miktarı

* Adaptör kullanımı farklı toplam RNA örneklerinin türlerine ve giriş miktarına göre ayarlanabilir

3.Kütüphane Amplifikasyonu

1) Birinci nesil DNA polimeraz temelinde, kitte bulunan yüksek kaliteli DNA polimeraz, amplifikasyon düzgünlüğünü büyük ölçüde iyileştirmiştir ve herhangi bir amplifikasyon önyargısı göstermemektedir.

2) Amplifikasyon döngüsü sayıları sıkı bir şekilde kontrol edilmelidir. Yetersiz amplifikasyon düşük kütüphane verimine yol açabilir; aşırı amplifikasyon artan önyargı, hatalar, tekrarlanan okuma, kimerik ürünler ve genişleme mutasyonlarının birikmesine neden olabilir. Tablo 2'de PCR amplifikasyonu için önerilen döngü sayıları listelenmiştir.

3) Tablo 2'de önerilen döngü sayısı, kütüphane hazırlama gereksinimlerinin büyük çoğunluğunu karşılayabilir. Örneğiniz düşük kalitedeyse (şiddetli bozunma olan FFPE örnekleri gibi), döngü sayısı gerçek duruma göre uygun şekilde artırılabilir. mRNA'nın farklı türlere ve dokulara göre değiştiğine dikkat edin, amplifikasyon döngülerinin sayısı ayarlanmalıdır.

Tablo 2 Giriş Toplam RNA hacmi ve önerilen amplifikasyon döngüleri Tablo *

[Not]: *Kütüphanenin verimi yalnızca girdi miktarı ve amplifikasyon çevrimi sayısıyla ilgili değildir, aynı zamanda örneklerin kalitesi, parçalanma koşulları ve sıralama koşullarından da etkilenir. Kütüphane oluşturma sürecinde, gerçek duruma göre en uygun koşulları seçin.

4. Boncuk Bazlı DNA Temizliği ve Boyut Seçimi

1) Kütüphane oluşturma sürecinde DNA saflaştırma manyetik boncukları gerektiren birden fazla adım vardır. DNA saflaştırma ve boyut seçimi için Hieff NGS™ DNA Seçim Boncuklarını (Yeasen Cat#12601) veya AMPure® XP manyetik boncuklarını (Beckman Cat#A63880) öneriyoruz.

2) Manyetik boncuk, kullanımdan önce oda sıcaklığına dengelenmelidir, aksi takdirde verim düşecek ve boyut seçme etkisi etkilenecektir.

3) Manyetik boncuklar kullanılmadan önce vorteks veya pipetleme yoluyla iyice karıştırılmalıdır.

4) Üstteki çözeltiyi aktarırken boncukları aspire etmeyin, boncukların eser miktarda bile olsa bulunması sonraki reaksiyonları etkileyebilir.

5) %80'lik etanolün taze hazırlanması gerekir, aksi takdirde geri kazanım verimi etkilenir.

6) Manyetik boncuklar, ürünü elüe etmeden önce oda sıcaklığında kurutulmalıdır. Yetersiz kuruluk, etanol kalıntısının sonraki reaksiyonları etkilemesine kolayca neden olur; aşırı kuruluk, manyetik boncukların çatlamasına ve saflaştırma veriminin azalmasına neden olur. Normalde, boncukların tamamen kuruması için oda sıcaklığında 3-5 dakika kurutmak yeterlidir.

7) İhtiyaç duyulması halinde, saflaştırılmış veya boyut seçilmiş DNA örnekleri TE tamponunda elüe edilerek 4°C'de 1-2 hafta veya -20°C'de 1 ay saklanabilir.

5.Kütüphane Kalite Analizi

Oluşturulan kütüphanenin kalitesi genel olarak konsantrasyon tespiti ve uzunluk dağılımı tespiti ile değerlendirilebilir.

6. Diğer Malzemeler

1) mRNA zenginleştirme kiti: Hieff NGS® mRNA İzolasyon Ana Kiti V2 (Yeasen Katalog No. 12629).

2) rRNA giderme kiti: Hieff NGS® MaxUp İnsan rRNA Tükenme Kiti (rRNA ve ITS / ETS) (Yeasen Cat # 12257) veya diğer rRNA giderme kiti.

3) Manyetik boncukların RNA saflaştırılması: Hieff NGS® RNA Temizleyici (Yeasen Cat # 12602) veya diğer eşdeğer ürünler.

4) DNA saflaştırılmış manyetik boncuklar: Hieff NGS® DNA Seçim Boncukları (Yeasen Cat # 12601) veya AMPure® XP Boncukları (A63880) veya diğer eşdeğer ürünler.

5) RNA kalite kontrolü: Agilent 2100 Bioanalyzer RNA 6000 Nano / Pico Chip veya diğer eşdeğer ürünler.

6) Adaptörler: Illumina® kullanımı için Tam Adaptör (Kat No. 13519-13520 veya diğer eşdeğeri) veya MGI® kullanımı için Tam Adaptör (Kat No. 13360-13362 veya diğer eşdeğeri).

7. Kütüphane kalite denetimi

Agilent 2100 Bioanalyzer DNA 1000 Çip / Yüksek Hassasiyetli Çip veya diğer eşdeğer ürünler; kütüphane kantifikasyon reaktifleri.

8. Diğer malzemeler

Susuz etanol, steril ultra saf su, düşük adsorpsiyonlu tabanca başlığı, PCR tüpü, manyetik çerçeve, PCR cihazı vb.

Akış şeması

Şekil 1: RNA kütüphanesi oluşturma süreci

Farklı kalitedeki FFPE örnekleri için RNA Kütüphanesi hazırlığı

Ciddi şekilde bozulmuş FFPE RNA (DV 200 < %50) ve düşük girdi örnekleri için, kütüphane kaybını azaltmak amacıyla adaptör ligasyonundan sonra Çift Saflaştırma protokolünü öneriyoruz.

Farklı kalitedeki FFPE numunelerinin tepe desenleri