Yüksek NGS^T.M. DNA Kütüphane Hazırlık Seti, özel olarak geliştirilmiş ve tasarlanmış yeni nesil bir kütüphane yapım setidir. Aydınlanma® &MGI® dizileme platformu. Önceki nesil kütüphane yapı kiti temelinde, bu ürün uç onarımı, dA-kuyruklama ve adaptör ligasyonunda önceki versiyonlara göre daha yüksek verimlilik sergiler. Yüksek doğruluklu enzim, amplifikasyonun tekdüzeliğini ve doğruluğunu önemli ölçüde iyileştirir. Kit, hayvanlardan/bitkilerden/mikroorganizmalardan alınan standart genomik DNA, FFPE örnekleri, cfDNA ve ChIP DNA dahil olmak üzere çoğu DNA örneği türüyle uyumludur.

Özellikler

Bileşenler

Depolamak

Bu ürün -25~-15℃'de saklanmalıdır. 1 yıl.

Notlar

1. Operasyon hakkında

1Lütfen güvenliğiniz için laboratuvar önlüğü ve tek kullanımlık eldivenlerle çalışın.

2. Bileşenleri oda sıcaklığında çözdürün. Çözüldükten sonra, vorteksleyerek iyice karıştırın, tüpü kısa bir süre döndürün ve daha sonra kullanmak üzere buz üzerine koyun.

3. Her adımın reaksiyon solüsyonunu hazırlarken, iyice karıştırmak veya hafifçe çalkalamak için bir pipet kullanılması önerilir. Şiddetli çalkalama, kütüphane çıktısında bir azalmaya neden olabilir.

4. Çapraz kontaminasyonu önlemek için filtreli pipet uçlarının kullanılması şiddetle önerilir. Farklı numuneleri işlerken pipet uçlarını değiştirdiğinizden emin olun.

5. Uygunsuz işlemler büyük olasılıkla aerosol kontaminasyonlarına neden olarak sonucun doğruluğunu etkileyebilir. PCR reaksiyon karıştırma bölgelerinin ve PCR ürün saflaştırma testi bölgelerinin zorunlu fiziksel izolasyonu önerilir. Kütüphane yapımı için özel pipetler gibi ekipmanlarla donatılmıştır.Her alan için rutin temizliği, yüzeyleri %0,5 sodyum hipoklorit veya %10 çamaşır suyu ile silerek gerçekleştirin.

6Bu ürün yalnızca araştırma amaçlıdır.

2. DNA Parçalanması

1. Bu kit hem mekanik olarak parçalanmış DNA hem de enzimatik olarak parçalanmış DNA ile uyumludur.

2. Kit 100 pg - 1000 ng giriş DNA'sı ile uyumludur. A260/A280 = 1.8-2.0 olan yüksek kaliteli giriş DNA'sı kullanılması şiddetle tavsiye edilir. Tablo 1'de önerilen Giriş DNA miktarı listelenmiştir.

Tablo 1 Giriş DNA'sının önerilen miktarı

Not:Giriş DNA'sı kalitesiz olduğunda veya DNA boyutu seçimi gerektiğinde, giriş DNA miktarı buna göre artırılmalıdır.

3.“Giriş DNA’sı” özellikle uç onarımı/dA kuyruğu için hazır DNA örneklerini ifade eder.

4. Giriş DNA örneği metal şelatlama maddesi gibi yüksek konsantrasyonlarda tuz içeriyorsa, parçalanma sonrası bir boncuk saflaştırma/boyut seçimi adımı önerilir. Tuzlar, uç onarımı ve dA kuyruğu dahil olmak üzere aşağıdaki reaksiyonların verimliliğini etkileyebilir. Mekanik parçalanma yöntemini kullanıyorsanız, parçalanma için DNA örneklerini sterilize edilmiş ultra saf su yerine TE Tamponunda elüe edin. Kütüphane hazırlamaya geçmeden önce boncuk temizliği veya boyut seçimi yapmadan enzimatik parçalanma yöntemini kullanıyorsanız, kullanılan durdurma tamponunun aşırı miktarda metal şelatlama maddesi içermediğinden emin olun. Aksi takdirde, lütfen parçalanmış örnekleri temizleyin veya boyut seçin ve kütüphane hazırlamaya geçmeden önce TE tamponunda veya sterilize edilmiş ultra saf suda (≤50 μL) elüe edin.

3. Adaptör Ligasyonu

1. Müşterilerin deneysel gereksinimlerine göre seçebilecekleri Illumina veya MGI Uzun Adaptör (Barkodlu Adaptör) kitleri ve kısa Adaptör kitleri mevcuttur.

2. Yüksek kaliteli, ticari adaptörlerin seçilmesi önerildi. Kendi kendine yapılan adaptörler seçilirse, lütfen NGS primer sentezinde deneyimli bir şirkete güvenin ve sıkı kontaminasyon kontrolüne ihtiyaç olduğunu belirtin. Ayrıca, çapraz kontaminasyonu önlemek için DNA tavlama solüsyonunun temiz bir tezgahta hazırlanması ve her seferinde yalnızca bir adaptör türü çalıştırılması önerilir..

3. Lütfen adaptörleri buz üzerinde veya 4°C'de çözdürün; oda sıcaklığında çalıştırıldığında adaptörlerin denatüre olmasını önlemek için laboratuvar sıcaklığı 25°C'yi geçmemelidir.

4. Adaptörlerin kalitesi ve konsantrasyonu, ligasyon verimliliğini ve kütüphane verimini doğrudan etkileyecektir. Çok yüksek adaptör konsantrasyonu, adaptör dimer oluşumunu desteklerken çok az adaptör, ligasyon oranını ve kütüphane verimini azaltır. Adaptör kullanıldığında Giriş DNA miktarına göre TE Tamponu ile ilgili seyreltmeler. Tablo 2 -5 Bu kit kullanılarak farklı Giriş DNA miktarları için önerilen Adaptör seyreltme yöntemleri listelenmiştir.

Masa 2 Önerilen Illumina^T.M. farklı giriş için adaptör miktarı DNA

Masa 3 Önerilen MGI^T.M. farklı giriş için adaptör miktarı DNA

Masa 4 Önerilen Illumina^T.M. ÜMİ farklı giriş için adaptör miktarı DNA

Masa 5 Önerilen MGI^T.M. ÜMİ adaptör aMfarklı giriş için sayım DNA

4. Boncuk Tabanlı DNA Temizliği ve Boyut Seçimi

1. DNA boyut seçimi uç onarımı/dA kuyruğundan önce, adaptör ligasyonundan sonra veya amplifikasyondan sonra gerçekleştirilebilir.

2. Giriş DNA miktarı 50 ng'den fazlaysa adaptör ligasyonundan hemen sonra boyut seçimi yapılması önerilir.; Aksi takdirde lütfen amplifikasyondan sonra boyut seçimini gerçekleştirin.

3. Ligasyon Güçlendirici, doğru boyut seçimi üzerinde önemli bir etkiye neden olabilecek yüksek konsantrasyonda PEG içerir. Bu nedenle, boyut seçimi adaptör ligasyonundan hemen sonra yapılacaksa, boyut seçiminden önce bir boncuk temizleme adımı eklenmesi şiddetle önerilir. Boyut seçimi adımı, uç onarımı/dA-kuyruklamadan önce veya sonra gerçekleştirilirse doğrudan gerçekleştirilebilir. kütüphane amplifikasyonu.

4. Manyetik boncuklar kullanılmadan önce oda sıcaklığında dengelenmelidir, aksi takdirde verim düşecek ve boyut seçme etkisi etkilenecektir.

5. Manyetik boncuklar kullanılmadan önce vorteks veya pipetleme yoluyla iyice karıştırılmalıdır.

6. Üstteki çözeltiyi aktarırken boncukları aspire etmeyin, boncukların eser miktarda bile olsa bulunması sonraki reaksiyonları etkileyebilir.

7. %80'lik etanolün taze hazırlanması gerekir, aksi takdirde geri kazanım verimi etkilenir.

8. Doğru boyut seçimi için 100 μL'den fazla bir hacimle başlanması önerilir. Daha az ise, hacmin ultra saf su ile 100 μL'ye çıkarılması önerilir.

9. Manyetik boncuklar, ürünü elüe etmeden önce oda sıcaklığında kurutulmalıdır. Yetersiz kuruluk, etanol kalıntısının sonraki reaksiyonları etkilemesine kolayca neden olur; aşırı kuruluk, manyetik boncukların çatlamasına ve saflaştırma veriminin azalmasına neden olur. Normalde, boncukların tamamen kuruması için oda sıcaklığında 3-5 dakika kurutmak yeterlidir.

10. Gerektiğinde, saflaştırılmış veya boyuta göre seçilmiş DNA örnekleri elüe edilir. 0,1× TE tamponu 4°C’de 1-2 hafta, -20°C’de ise 1 ay saklanabilir.

5. Kütüphane Amplifikasyonu

1. Kütüphane amplifikasyonunun yapılıp yapılmayacağı DNA girişinin miktarına, adaptörlerin tiplerine, dizileme verisi uygulamalarına vb. bağlıdır. Kısmi adaptörler kullanılıyorsa amplifikasyon adımı gereklidir. Tam uzunlukta adaptörler kullanıldığında, giriş DNA'sı < 200 ng ise amplifikasyon yapılması önerilir; aksi takdirde amplifikasyon gerekli değildir.

2. Amplifikasyon döngüsü sayıları sıkı bir şekilde kontrol edilmelidir. Yetersiz amplifikasyon düşük kütüphane verimine yol açabilir; Aşırı amplifikasyon artan önyargı, hatalar, tekrarlanan okuma ve kimerik ürünlere neden olabilir. Tablo 6 1 μg kütüphane verimini hedefleyen önerilen çevrim sayılarını listeler.

Masa 6 Üretilecek önerilen döngü sayısı 1.000 ng kütüphane verimi

Not：

1.Masa 6 yaklaşık 200 bp'lik yüksek kaliteli Giriş DNA testlerini kullanarak döngü parametrelerinin sayısını gösterir. FFPE DNA kalitesi büyük ölçüde değişir ve DNA kalitesi düşük olduğunda veya kütüphane uzunluğu uzun olduğunda, yeterli kütüphane elde etmek için döngü sayısının uygun şekilde artırılması gerekir.

2.BENKütüphane oluşturma sürecinde boyut seçimi gerekiyorsa Kütüphane Amplifikasyonu için daha yüksek döngü sayısı önerilir; aksi takdirde daha düşük döngü sayısı önerilir.

3.BENEksik adaptörler kullanıldığında, tam bir adaptör oluşturmak için en az 2 çevrimin yükseltilmesi gerekir.

6. Kütüphane Kalite Analizi

1. Oluşturulan kütüphanelerin kalitesi genellikle konsantrasyonların ve boyut dağılımlarının ölçülmesiyle analiz edilir.

2. Kütüphaneler'Konsantrasyonlar Qubit ve PicoGreen gibi floresan tabanlı yöntemlerle veya qPCR ile ölçülebilir.

3.NanoDrop gibi absorbans bazlı kantifikasyon yöntemlerinin kullanılması ÖNERİLMEZ.

4. Kütüphane kantifikasyonu için qPCR yönteminin kullanılması önerilir: Qubit ve PicoGreen gibi floresan tabanlı yöntemler, eksik dsDNA yapılarını (adaptörsüz veya sadece bir ucu adaptörle bağlanmış ekler) tam kütüphanelerden ayırt edemez. qPCR yöntemi sadece her iki ucu adaptörlerle bağlanmış tam kütüphaneleri (sekanslanabilir kütüphaneler) çoğaltacak ve ölçecektir, böylece yükleme için daha doğru bir ölçüm sağlayacaktır.

5. Kütüphanelerin boyut dağılımı, Agilent Bioanalyzer veya kapiler elektroforez veya mikroakışkanlık prensiplerine dayanan diğer cihazlar kullanılarak analiz edilebilir.

7. Diğer Malzemeler

1. DNA saflaştırma manyetik boncukları: Hieff NGS^T.M. DNA Seçim Boncukları (Yeasen Cat#12601) veya AMPure^® XP Boncuk (A63880) veya diğer eşdeğer ürünler.

2. Adaptörler: Illumina için Tam Adaptör: Yeasen Kedisi#13519-13520; 384 Çift CDI Primerleri: Evet Kedi#12412~Kedi#12413; 384 Benzersiz Çift İndeks (UDI) Primerleri: Yeasen Kedi #12312~Kedi#12315; UMI UDI Bağdaştırıcıları: Evet Kedi#13370~Kedi#13371; MGI için Komple Adaptör: Yeasen Cat#13360-13362. DNA Primer Karışımı：Kedi#12190 veya Kedi#12191.

3. Kütüphane kalite analizi: Agilent 2100 Bioanalyzer DNA 1000 Çip/ Yüksek Hassasiyetli Çip veya diğer eşdeğer ürünler; kütüphane kantitatif reaktifleri.

4. Diğer malzemeler: mutlak etanol, steril ultra saf su, düşük tutulumlu pipet uçları, PCR tüpü, manyetik standlar, termal döngü cihazı, vb.

Talimatlar

Adım 1. Son Onarım/dA-Taling

1. Çözülme Tablo'da belirtilen reaktifler 7 . Reaktifleri iyice karıştırmak için ters çevirin ve daha sonra kullanmak üzere buz üzerine koyun.

2. Reaktifleri Tabloya göre birleştirin 7 buz üstünde.

Masa 7 Son Onarım/ dA-Kuyruklama reaksiyon sistemi

3. Pipetleme veya çalkalama yoluyla yavaşça karıştırın. Çözeltiyi aşağıya indirmek için kısa bir süre santrifüjleyin.

4. Tüpü termocycler'a yerleştirin ve programı Tablo 8'e göre ayarlayın.

Masa 8 Son Onarım/dA-Tailing tepki programı

Adım 2. Adaptör Ligasyonu

1. Adaptörü Tablo 2'ye göre uygun konsantrasyona kadar seyreltin-5.

2. Çözülme Tablo'da belirtilen reaktifler 9 . Reaktifleri iyice karıştırmak için ters çevirin ve daha sonra kullanmak üzere buz üzerine koyun.

3. Reaktifleri Tabloya göre birleştirin 9 buz üstünde.

Masa 9 Adaptör Ligasyonu tekrareylem sistemi

Not: *Ligasyon Güçlendirici viskozdur. Lütfen ters çevirerek veya tepe noktasına getirerek iyice karıştırın ve Kullanmadan önce kısa bir süre santrifüjleyin.

**Orijinal konsantrasyon Aydınlanma^T.M. YEASE adaptörü 15 μM'dir. Lütfen adaptörü giriş miktarına göre seyreltin Ve Adaptörün hacmini 5 μL'ye sabitleyin.

**Orijinal konsantrasyon MGI^T.M. YEASE'nin adaptörü 1'dir0 μM. Lütfen adaptörü giriş miktarına göre seyreltin Ve Adaptörün hacmini 5 μL'ye sabitleyin.

4. Pipetleme aparatını yavaşça yukarı aşağı hareket ettirerek iyice karıştırın ve tüpün kenarlarındaki tüm sıvıyı toplamak için kısa bir süre aşağı doğru döndürün..

5. Örneği Tablo'da gösterildiği gibi önceden ısıtılmış bir termal döngü cihazında inkübe edin. 10 ve adaptör bağlantı reaksiyonunu gerçekleştirin.

Masa 10 Adaptör Ligasyon reaksiyon programı

Adım 3. Adaptör Ligasyonu sonrası Temizleme veya Boyut Seçimi

Bu adım, adımdaki ürünü arındırmak veya boyut seçmek içindir. 2 manyetik boncuklarla. Arıtma, kalıntı adaptörleri, adaptör dimerleri veya diğer kullanılamaz ürünleri kaldırabilir.

TemizN Adaptör-ligate edilmiş DNA'nın yukarısı

1. Hazırlık: Hieff NGS'yi alın^T.M. DNA Seçim Boncuklarını buzdolabından çıkarın ve en az 30 dakika oda sıcaklığında dengeleyin. %80 etanolü taze olarak hazırlayın.

2. Boncukları ters veya tepetaklak ederek iyice karıştırın.

3. Eklemek 88 μL Yüksek NGS^T.M. DNA Seçim Boncukları (0.8×, Boncuklar : DNA = 0.8:1) adaptörle bağlanmış ürünü içeren tüpe aktarın, iyice çalkalayın, karıştırın ve oda sıcaklığında 5 dakika inkübe edin.

4. Çözeltiyi aşağı indirmek için kısa bir süre santrifüjleyin ve santrifüj tüpünü manyetik rafa yerleştirin. Manyetik boncuklar tamamen adsorbe edildikten sonra (yaklaşık 5 dakika), sıvıyı dikkatlice çıkarın.

5. Tüpü manyetik standın üzerinde tutun, Tüpe doğrudan 200 μL taze hazırlanmış %80 etanol ekleyin. Oda sıcaklığında 30 saniye inkübe edin ve sıvıyı dikkatlice çıkarın.

6. Tekrarlamak Adım 5 tekrar.

7. Tüpü manyetik standın üzerine koyun, kapağını açın ve boncuklar çatlayana kadar (en fazla 5 dakika) kurutun.

8. Elüsyon için tüpü manyetik standdan çıkarın ve DNA'yı elüe edin

1). Ürünün boyut seçimine gerek yoksa 21 μL ddH ekleyin₂O doğrudan. 10 kez yukarı aşağı pipetleme veya vorteksleme ile iyice karıştırın. Oda sıcaklığında 5 dakika inkübe edin. Tüpü kısa bir süre döndürün ve manyetik standa yerleştirin. Çözelti berraklaştığında (yaklaşık 5 dakika), manyetik boncuklara dokunmadan 20 μL süpernatantı dikkatlice yeni bir PCR tüpüne aktarın.

2). Ürünün boyutunun seçilmesi gerekiyorsa 102 μL ddH ekleyin₂O doğrudan. Vorteksleyerek veya 10 kez yukarı aşağı pipetleyerek iyice karıştırın. Oda sıcaklığında 5 dakika inkübe edin. Tüpü kısa bir süre döndürün ve manyetik standa yerleştirin. Çözelti berraklaştığında (yaklaşık 5 dakika), manyetik boncuklara dokunmadan 100 μL süpernatantı dikkatlice yeni bir PCR tüpüne aktarın.

Not: Eğer saflaştırılmış ürünün saklanması gerekiyorsa TE Tamponu ile elüe edilebilir.

Adaptörle Bağlanmış DNA'nın Boyut Seçimi

1.Hazırlık: Hieff NGS'yi alın^T.M. DNA Seçim Boncuklarını buzdolabından çıkarın ve en az 30 dakika oda sıcaklığında dengeleyin. %80 etanolü taze olarak hazırlayın.

2. Boncukları ters veya tepetaklak ederek iyice karıştırın.

3. Hedeflenen boyutlara göre, Tablo'ya göre 100 μL saflaştırılmış DNA şablonlarına ilk boncuk turunu ekleyin. 11. 10 kez vorteksleyerek veya pipetleyerek iyice karıştırın.

Masa 11 Önerilen Boncuklar:Boncuk bazlı boyut seçimi için DNA oranları

Not: Tablodaki "×" DNA örneğinin hacmini belirtir. Örneğin, kütüphanenin insert uzunluğu 250 bp ve örnek DNA hacmi 100 μL ise, ilk sıralama turunda kullanılan manyetik boncukların hacmi 0,7×100 μL=70 μL'dir; ikinci sıralama turunda kullanılan manyetik boncukların hacmi 0,20×100 μL=20 μL'dir. Tabloda önerilen boncuk hacmi adaptörle bağlanmış DNA içindir. Bağlamadan önce boyut seçimi prosedürü gerçekleştirilirse lütfen Hieff NGS üretim protokollerine bakın^T.M. DNA Seçim Boncukları (Kat#12601).

4. BENOda sıcaklığında 5 dakika bekletin.

5. Tüpü kısa bir süre döndürün ve manyetik standa yerleştirin. Çözelti berraklaştığında (yaklaşık 5 dakika), üstteki sıvıyı yeni bir PCR tüpüne aktarın.

6. 5. adımdaki örneğe ikinci tur seçme boncuklarını ekleyin Tabloya göre 11.En az 10 kez vorteksleyerek veya pipetleme yaparak iyice karıştırın.

7. BEN5 dakika oda sıcaklığında bekletin.

8. Çözeltiyi aşağı indirmek için kısa bir süre santrifüjleyin ve santrifüj tüpünü manyetik rafa yerleştirin. Manyetik boncuklar tamamen adsorbe edildikten sonra (yaklaşık 5 dakika), sıvıyı dikkatlice çıkarın.

9. Tüpü manyetik standın üzerinde tutun, Tüpe doğrudan 200 μL taze hazırlanmış %80 etanol ekleyin. Oda sıcaklığında 30 saniye inkübe edin ve sıvıyı dikkatlice çıkarın.

10. Tekrarlamak adım 9 Tekrar.

11. Tüpü manyetik standın üzerine koyun, kapağını açın ve boncuklar çatlayana kadar (en fazla 5 dakika) kurutun.

12. Elüsyon için tüpü manyetik standdan çıkarın, Ve doğrudan 21 μL ddH ekleyin₂O. Vorteksleyerek veya pipetleme yaparak iyice karıştırın ve oda sıcaklığında 5 dakika inkübe edin. (Not: saflaştırılmış ürünü saklamanız gerekiyorsa, lütfen TE Tamponunda elüsyon yapın.) Tüpü kısa bir süre döndürün ve sıvı berraklaşana kadar (yaklaşık 5 dakika) manyetik bir standa yerleştirin. Boncuklara dokunmadan 20 μL süpernatantı dikkatlice yeni bir PCR tüpüne aktarın.

Adım 4 Kütüphane Amplifikasyonu

Bu adım, saflaştırılmış veya boyut seçilmiş ürünlerin PCR amplifikasyonu ile zenginleştirilmesini sağlayabilir.

1. Tabloda listelenen reaktifleri çözün 12, ters çevirip iyice karıştırın ve daha sonra kullanmak üzere buz üzerine koyun.

2. Aşağıdaki reaksiyonu steril bir PCR tüpüne yerleştirin.

Masa 12 adaptör-ligate edilmiş DNA PCR reaksiyonu sistem

[Not]: * Eğer adaptörün tamamı kullanılmışsa, Yüksek NGS^T.M. Astar Karışımı (Yeasen Kedi #12190 veya Cat#12191) ihtiyaç halinde; Eksik bir adaptör kullanılırsa (Cat#12412~Cat#12413, Cat#12312~Kedi#12315, Cat#13370~Cat#13371), lütfen kit talimatlarına bakın ve amplifikasyon için kitte verilen Endeks Primerini kullanın.

3. Pipetleme veya çalkalama yoluyla yavaşça karıştırın ve çözeltiyi aşağıya indirmek için kısa bir süre santrifüjleyin.

4. Tüpü bir termocycler'a yerleştirin ve programı tabloya göre ayarlayın 13 amplifikasyonu başlatmak için.

Masa 13 PCR amplifikasyon reaksiyon programı

Adım 5 Amplifikasyon Sonrası Temizlik/Boyut Seçimi

Temiz yukarı adımlar, şu anlama gelir adım 3. Yüksek NGS^T.M. DNA Seçim Boncukları (0,9×, Boncuklar:DNA=0,9:1) PCR ürününü saflaştırmak için kullanılır. Boyut seçimi gerekiyorsa lütfen şuraya bakın: adım 3.

Adım 6 Son Kütüphanelerin Kalite Kontrolü

Oluşturulan kütüphanenin kalitesi genellikle konsantrasyon ve boyut dağılımı ölçülerek değerlendirilir. Ayrıntılar için lütfen Not'a bakın 6.