Tanım
Hücre Sayım Kiti-8 (CCK-8), WST-8 (2-(2-metoksi-4-nitrofenil)-3-(4-nitrofenil)-5-(2,4-disülfofenil)-2H-tetrazolium monosodyum tuzu) reaktifine dayalı hızlı ve oldukça hassas bir tespit kitidir. WST-8, MTT'nin yükseltilmiş bir reaktifidir ve mitokondrilerdeki dehidrogenazlar tarafından oldukça suda çözünür turuncu-sarı bir formazana indirgenebilir. Üretilen formazan miktarı canlı hücre sayısıyla orantılıdır. Bir mikro plaka okuyucusu tarafından tespit edilen 450 nm'deki formazan OD değeri, dolaylı olarak canlı hücre sayısını gösterebilir. Bu kit, ilaç taraması, hücre çoğalması ve sitotoksisite testleri, tümör ilacı duyarlılığı testi ve biyolojik faktörlerin aktivite tespiti için yaygın olarak kullanılır.
CCK-8 yönteminin avantajları
1. CCK-8 yönteminin diğer hücre çoğalması/toksisite tespit yöntemleriyle karşılaştırılması.
| Tespit yöntemi | MTT yöntemi | XTT yöntemi | WST - 1 yöntemi | CCK 8 yöntemi |
|---|---|---|---|---|
| Formazan ürününün suda çözünürlüğü | Düşük (çözülmesi için organik çözücü eklenmesi ve ardından test edilmesi gerekir) | Yüksek | Yüksek | Yüksek |
| Ürün özellikleri | Toz | 2 şişe çözelti | Çözüm | 1 şişe solüsyon |
| Kullanım yöntemi | Çözeltiye karıştırın ve kullanın | Çözelti kullanımdan hemen önce hazırlandı. | Kutunun dışında | Kutunun dışında |
| Algılama hassasiyeti | Yüksek | Çok yüksek | Çok yüksek | Yüksek |
| Tespit zaman | Uzun | Kısa | Kısa | En kısa |
| Algılama dalga boyu | 560-600 nm | 420-480 nm | 420-480 nm | 430-490 nm |
| sitotoksisite | Yüksek toksisite, hücre morfolojisinin tamamen kaybolması | Düşük toksisite, hücre morfolojisi değişmedi | Düşük toksisite, hücre morfolojisi değişmedi | Düşük toksisite, hücre morfolojisi değişmedi |
| Reaktif kararlılığı | Genel | Düşük | Genel | Yüksek |
| Toplu numune testi | Uygulanabilir | Uygun | Uygun | Uygun |
2. Fenol kırmızısı ve serum CCK-8 tespitini etkilemez.
3. CCK-8 reaktifinin sitotoksisitesi çok düşük olduğundan, CCK-8 reaktifi eklendikten sonra farklı zamanlarda mikro plaka okuyucu ile tekrar tekrar okunarak optimum ölçüm zamanı belirlenebilir.
Nakliye ve Depolama
Ürün -25~-15ºC'de kuru ve karanlık bir yerde iki yıl saklanabilir.
Önlemler
1. İlk deneyde, optimum plaka hücre sayısı ve CCK-8 reaktifinin optimum inkübasyon süresinin belirlenmesi önerilir.
2. Mümkünse, tekrar kuyuları arasındaki varyasyonları azaltmak için çok kanallı bir pipet kullanın. Deneyde kabarcıklardan kaçının çünkü kabarcıklar OD okumasını engelleyecektir. CCK-8 reaktifini eklerken, kültür ortamına yerleştirmek yerine kültür plakasının duvarına yakın bir yere eklemeniz önerilir.
3. Beyaz kan hücrelerinin inkübasyon süresi daha uzun olabilir.
4. Standart 96 kuyulu bir plaka kullanıldığında, plakaya eklenen hücre sayısı en az 1.000 hücre/kuyudur (100 μL). Beyaz kan hücreleri için tespit hassasiyeti nispeten düşüktür, bu nedenle en az 2.500 hücre/kuyu (100 μL) plakalanması önerilir. 24 kuyulu veya 6 kuyulu bir plaka kullanılıyorsa, her kuyu için karşılık gelen hücre sayısını hesaplayın ve uygun hacimde CCK-8 reaktifi ekleyin (eklenen CCK-8 reaktifi hacmi, plakanın her kuyusundaki kültür ortamının hacminin %10'udur).
5.Eğer 450 nm filtre mevcut değilse, 430-490 nm arasında absorbansa sahip bir filtre kullanılabilir, ancak 450 nm filtre en yüksek tespit hassasiyetine ulaşabilir.
6. Fenol kırmızısı ölçümü etkilemez çünkü ortamdaki fenol kırmızısının absorbansı, boş grubun absorbansının çıkarılmasıyla ortadan kaldırılabilir.
7. Deneyi yaparken kendi güvenliğiniz ve sağlığınız için lütfen laboratuvar önlüğünüzü ve tek kullanımlık eldivenlerinizi giyin.
Talimatlar
I. Standart bir eğri oluşturun
1. Hücre süspansiyonunu hazırlayın, hücre yoğunluğunu belirleyin ve ardından hücreleri plakalayın.
2. Hücreleri kültür ortamıyla belirli bir oranda (örneğin 1:2 oranında) sırayla seyreltin ve bir hücre konsantrasyon gradyanı oluşturun, genellikle 3-5 hücre konsantrasyon gradyanı, her konsantrasyon için 3-6 tekrar kuyusu.
3. Plakalandıktan sonra, hücreleri yapışmaları için 2-4 saat kültürleyin. Ardından, CCK-8 reaktifini ekleyin, belirli bir süre inkübe edin ve OD değerini ölçün. Hücre numarasını X ekseni ve OD değerini Y ekseni olarak kullanarak bir standart eğri çizin. Bu standart eğriye göre, bilinmeyen bir örnekteki hücre sayısı belirlenebilir (Bu standart eğriyi kullanmanın öncülü, deneysel koşulların tutarlı olmasıdır).
II. Hücre canlılığı testi
1. Hücreleri (100 μL/kuyu) 96 kuyulu bir plakaya yerleştirin. Plakayı bir inkübatöre (37°C, %5 CO) yerleştirin2) ön kuluçka için bir süre bekletilir.
2. Her kuyuya 10 μL CCK-8 reaktifi ekleyin (OD okumasını engellediği için kuyularda kabarcık oluşmamasına dikkat edin) ve yavaşça karıştırın.
3. Plakayı inkübatöre yerleştirin ve 1-4 saat inkübe edin.
4. Mikroplaka okuyucusu ile 450 nm'de absorbansı ölçün.
5. OD değeri hemen ölçülmezse, her bir kuyuya 10 μL 0,1 M HCl çözeltisi veya %1 w/v SDS çözeltisi ekleyin, plakayı kapatın ve oda sıcaklığında ışıktan koruyarak saklayın. Absorbans değeri 24 saat içinde değişmeyecektir.
III. Hücre çoğalması ve sitotoksisite testi
1. Hücreleri (100 μL/kuyu) 96 kuyulu bir plakaya yerleştirin. Plakayı bir inkübatöre (37°C, %5 CO) yerleştirin2) 24 saat ön inkübasyona tabi tutulur.
2. Test edilecek maddenin farklı konsantrasyonlarından 10 μL’yi plakaya ekleyin.
3. Plakayı inkübatöre yerleştirin ve belirli bir süre (örneğin 6, 12, 24 veya 48 saat) inkübe edin.
4. Her kuyuya 10 μL CCK-8 reaktifi ekleyin (OD okumasını engellediği için kuyularda kabarcık oluşmamasına dikkat edin) ve yavaşça karıştırın.
5. Plakayı inkübatöre yerleştirin ve 1-4 saat inkübe edin.
6. Mikroplaka okuyucusu ile 450 nm'de absorbansı ölçün.
7. OD değeri hemen ölçülmezse, her bir kuyuya 10 μL 0,1 M HCl çözeltisi veya %1 w/v SDS çözeltisi ekleyin, plakayı kapatın ve oda sıcaklığında ışıktan koruyarak saklayın. Absorbans değeri 24 saat içinde değişmeyecektir.
Not: Madde oksitleyici veya indirgeyici ise, maddenin etkisini ortadan kaldırmak için CCK-8 reaktifini eklemeden önce eski kültür ortamını taze ortamla değiştirin (eski ortamı çıkarın, hücreleri iki kez taze ortamla yıkayın ve ardından taze ortam ekleyin).Eğer maddenin kendisi sadece A hafif Absorbans değerine etkisi olmadığı için kültür ortamının değiştirilmesine gerek kalmaz ve maddenin etkisi, madde içeren boş bir grubun absorpsiyon değerinden çıkarılmasıyla ortadan kaldırılabilir.
Hesaplama formülü
Hücre sağkalım oranı =[(AC) /(BC)] x100%
İnhibisyon oranı =[(BA) /(BC)] x100%
A: Deney grubunun absorbansı (hücreleri, CCK-8 reaktifini ve test edilecek maddeyi içeren kültür ortamının absorbansı)
B: Kontrol grubunun absorbansı (hücreleri içeren kültür ortamının, CCK-8 reaktifinin absorbansı)
C: Boş grubun absorbansı (CCK-8 reaktifini içeren kültür ortamının absorbansı)
Alıntılar
[1] Sun L, Li P, Ju X ve diğerleri. İçinde SARS-CoV-2 RNA genomunun vivo yapısal karakterizasyonu, yeniden kullanılan ilaçlara karşı hassas olan konak proteinlerini belirler. Hücre. 2021;184(7):1865-1883.e20. doi:10.1016/j.cell.2021.02.008(EĞER:41.584)
[2] Wei S, Zhao Q, Zheng K, ve diğerleri. GFAT1 bağlantılı TAB1 glutamilasyon p38 MAPK aktivasyonunu sürdürür ve glikoz açlığı altında akciğer kanseri hücrelerinin hayatta kalmasını destekler. Cell Discov. 2022;8(1):77. 9 Ağustos 2022'de yayımlandı. doi:10.1038/s41421-022-00423-0(EĞER:38.079)
[3] Chen X, Zhang D, Su N, ve diğerleri. Canlı hücrelerde RNA dinamiklerinin parlak ve kararlı floresan RNA'larla görselleştirilmesi. Nat Biotechnol. 2019;37(11):1287-1293. doi:10.1038/s41587-019-0249-1(EĞER:31.864)
[4] Yang F, Xiao Y, Ding JH, ve diğerleri. Üçlü negatif meme kanserinde ferroptoz heterojenliği, yenilikçi bir immünoterapi kombinasyon stratejisini ortaya koyuyor [baskıdan önce çevrimiçi olarak yayınlandı, 11 Ekim 2022]. Hücre Metab. 2022;S1550-4131(22)00411-9. doi:10.1016/j.cmet.2022.09.021(EĞER:31.373)
[5] Rong QX, Wang F, Guo ZX ve diğerleri. GM-CSF, ekstranodal doğal katil/T hücreli lenfomada PD-L1 ekspresyonunun yukarı regülasyonu yoluyla bağışıklık kaçışını aracılık eder. Mol Cancer. 2021;20(1):80. 29 Mayıs 2021'de yayımlandı. doi:10.1186/s12943-021-01374-y(EĞER:27.401)
[6] Xia B, Shen X, He Y ve diğerleri. SARS-CoV-2 zarf proteini akut solunum sıkıntısı sendromu (ARDS) benzeri patolojik hasarlara neden olur ve antiviral bir hedef oluşturur. Hücre Araştırması 2021;31(8):847-860. doi:10.1038/s41422-021-00519-4(EĞER:25.617)
[7] Yang X, Zhao X, Zhu Y, ve diğerleri. FBXO34, transkripsiyon sonrası modülasyon yoluyla latent HIV-1 aktivasyonunu teşvik eder. Emerg Microbes Infect. 2022;11(1):2785-2799. doi:10.1080/22221751.2022.2140605(EĞER:19.568)
[8] Zhou Z, Zhang X, Lei X ve diğerleri.cGAS tarafından sitoplazmik kromatinin algılanması SARS-CoV-2 enfeksiyonunda doğuştan gelen bağışıklık tepkisini aktive eder. Sinyal Transduct Hedefi Ther. 2021;6(1):382. 2021 Kasım 3'te yayımlandı. doi:10.1038/s41392-021-00800-3(EĞER:18.187)
[9] Li M, Hao B, Zhang M, ve diğerleri. Melatonin, radyofrekans kaynaklı NK antitümör bağışıklığını artırarak kanser metabolizmasının yeniden programlanmasına ve çoklu akciğer tümörü gelişiminin inhibisyonuna neden olur. Sinyal Transdüktüsü Hedefi Ther. 2021;6(1):330. 2021 Eylül 1'de yayımlandı. doi:10.1038/s41392-021-00745-7(EĞER:18.187)
[10] Qi S, Zhu Y, Liu X, ve diğerleri. WWC proteinleri, Hippo kinazları tarafından LATS1/2 aktivasyonuna aracılık eder ve bir tümör baskılama stratejisini ima eder. Mol Cell. 2022;82(10):1850-1864.e7. doi:10.1016/j.molcel.2022.03.027(EĞER:17.970)
[11] Zhu J, Li X, Cai X, ve diğerleri. PRMT7 tarafından arginin monometilasyonu MAVS aracılı antiviral doğuştan bağışıklığı kontrol eder. Mol Cell. 2021;81(15):3171-3186.e8. doi:10.1016/j.molcel.2021.06.004(EĞER:17.970)
[12] Teng KX, Niu LY, Xie N, Yang QZ. NADH'nin eş zamanlı oksidasyonu ve süperoksit radikalinin üretimi için supramoleküler fotodinamik ajanlar. Nat Commun. 2022;13(1):6179. 2022 Ekim 19'da yayımlandı. doi:10.1038/s41467-022-33924-3(EĞER:17.694)
[13] Zhong J, Guo Y, Lu S, ve diğerleri. Verimli APC-Asef inhibitörlerini keşfetmek için duyarlılık artırılmış bir izleyicinin rasyonel tasarımı. Nat Commun. 2022;13(1):4961. 24 Ağustos 2022'de yayımlandı. doi:10.1038/s41467-022-32612-6(EĞER:17.694)
[14] Liu F, Wang X, Duan J, ve diğerleri. AURKA'nın Zamansal PROTAC Kokteyli Aracılı Sıralı Bozunumu Akut Miyeloid Lösemi Kök Hücrelerini Ortadan Kaldırır. Adv Sci (Weinh). 2022;9(22):e2104823. doi:10.1002/advs.202104823(EĞER:16.806)
[15] Ji C, Qiu M, Ruan H, ve diğerleri. Transkriptom Analizi, Kemik Kusur İyileşmesini Hızlandırmak İçin 3B İskelelerin Simbiyoz Nişini Ortaya Çıkardı. Adv Sci (Weinh). 2022;9(8):e2105194. doi:10.1002/advs.202105194(EĞER:16.806)
[16] Feng L, Dou C, Xia Y, ve diğerleri. İskemik Beyin Hasarı ve Uzun Dönemli Nörolojik Fonksiyonel İyileşme için Nötrofil Benzeri Hücre Zarı Kaplı Nanozim Terapisi. ACS Nano. 2021;15(2):2263-2280. doi:10.1021/acsnano.0c07973(EĞER:15.881)
[17] Wang Z, Gong X, Li J, ve diğerleri. Oksijen Dağıtan Poliflorokarbon Nanotaşıtlar Tümör Oksijenasyonunu İyileştirir ve Fotodinamik Aracılı Antitümör Bağışıklığını Güçlendirir. ACS Nano. 2021;15(3):5405-5419. doi:10.1021/acsnano.1c00033(EĞER:15.881)
[18] Jiang Z, He L, Yu X, ve diğerleri. Antianjiyogenez, Hipoksi Yolunun İnhibisyonu ile Birleştiğinde Düşük Dozlu, X-ışınıyla Tetiklenen Fotodinamik Terapiyi Kolaylaştırır [baskıdan önce çevrimiçi olarak yayınlanmıştır, 25 Haziran 2021]. ACS Nano. 2021;10.1021/acsnano.1c01063. doi:10.1021/acsnano.1c01063(EĞER:15.881)
[19] Gong X, Li J, Xu X, ve diğerleri. Mikrovezikülden ilham alan oksijen ileten nanosistem, tümör stromasının radyoterapi aracılı modülasyonunu ve antitümör bağışıklığını güçlendirir. Biyomalzemeler. 2022;290:121855. doi:10.1016/j.biomaterials.2022.121855(EĞER:15.304)
[20] Deng J, Xu W, Lei S, ve diğerleri. Pankreas Kanseri İmmünoterapisini Hedeflemek İçin Duyarlı Nanojeller Tarafından Aktifleştirilmiş Doğal Katil Hücrelere Bağımlı Dendritik Hücrelerin Toplanması ve Olgunlaştırılması. Küçük. 2022;18(44):e2203114. doi:10.1002/smll.202203114(EĞER:15.153)
Ödeme ve Güvenlik
Ödeme bilgileriniz güvenli bir şekilde işlenir. Kredi kartı ayrıntılarını saklamıyoruz veya kredi kartı bilgilerinize erişimimiz yok.
Sorgu
Ayrıca sevebilirsiniz
SSS
Ürün yalnızca araştırma amaçlıdır ve insanlarda veya hayvanlarda terapötik veya teşhis amaçlı kullanım için tasarlanmamıştır. Ürünler ve içerikler, Yeasen Biotechnology'nin sahip olduğu patentler, ticari markalar ve telif haklarıyla korunmaktadır. Ticari marka sembolleri, tüm bölgelerde tescilli olmayıp, menşe ülkesini gösterir.
Bazı uygulamalar üçüncü tarafların ek fikri mülkiyet haklarına ihtiyaç duyabilir.
Yeasen, araştırmalarımızın güvenlik ve etik standartları sağlarken kritik soruları ele alması gerektiğine inanarak etik bilime kendini adamıştır.