Annexin V-EGFP/PI hücre apoptoz tespit kiti, erken hücre apoptozunun oluşumunu tespit etmek için bir prob olarak EGFP etiketli Annexin V'yi kullanır.
Tespit prensibi şu şekildedir: normal canlı hücrelerde fosfotidilserin (PS) hücre zarının iç tarafında bulunur, ancak erken apoptotik hücrelerde PS hücre zarının iç tarafından hücre zarının yüzeyine döner ve hücre dışı ortama maruz kalır. Annexin-V bir Ca²⁺ PS'ye yüksek afiniteyle bağlanan, moleküler ağırlığı 35 ila 36 kDa olan, bağımlı fosfolipit bağlayıcı protein. Fosfatidil serin, hücrenin dışındaki açığa çıkmış fosfatidil serin aracılığıyla erken apoptotik hücrelerin zarına bağlanabilir.
Ek olarak, hayatta kalan erken hücreleri nekrotik veya geç apoptotik hücrelerden ayırt etmek için Propidium İyodür (PI) sağlanır. PI, normal hücrelerin veya erken apoptotik hücrelerin sağlam hücre zarından geçemeyen ancak geç apoptotik ve nekrotik hücrelerin hücre zarından geçebilen ve çekirdeği kırmızı yapabilen bir nükleik asit boyasıdır. Bu nedenle, Annexin V, PI ile birleştirildiğinde, PI canlı hücrelerden dışlanmıştır (Annexin V^-/Pİ^-) ve erken apoptotik hücreler (Annexin V)⁺/Pİ^-). Geç apoptotik ve nekrotik hücreler hem EGFP hem de PI için çift pozitifti (Annexin V⁺/Pİ⁺).
Bu kit akış sitometrisi ve floresan mikroskopisi için uygundur.

Ürün Bileşenleri

Nakliye ve Depolama

Bileşenler buz torbasıyla birlikte gönderilir ve -20°C'de, ışıktan uzak, tekrar tekrar dondurulup çözülmeden 1 yıl saklanabilir.
[Notlar]: Kısa bir süre içerisinde tekrar tekrar kullanılması gerekiyorsa, 4 ℃'de ve ışıktan korunarak yarım yıl saklanabilir.

Dikkat Edilmesi Gerekenler

1) Apoptozis hızlı bir süreç olduğundan, örneklerin boyama sonrası 1 saat içinde analiz edilmesi önerilir.
2) Yapışık hücreler için sindirim kritik bir adımdır. Sindirim solüsyonunda EDTA kullanmayın çünkü EDTA, Annexin V'nin PS'ye bağlanmasını etkileyebilir.
3) Annexin V-FITC, ancak Annexin V-EGFP değil, hücreleri sabitlemek için kullanılmalıdır, örneğin apoptozu ve hücre döngüsünü aynı anda tespit etmek için, çünkü EGFP denatüre olur ve fiksasyon sırasında floresansı uyarma yeteneğini kaybeder. Hücreler fiksasyondan önce Annexin V-FITC ile inkübe edildi ve bağlanmamış Annexin V-FITC, Bağlayıcı Tampon ile yıkandı.Çünkü fiksasyon sırasında hücre geçirgenliğinin artması, Annexin V'e bağlanabilen ve sonuçları etkileyebilen hücre artıkları yaratır.
4) Örnek kandan alınmışsa, kandan trombositleri çıkardığınızdan emin olun. Çünkü trombositler, Annexin V'e bağlanabilen ve sonuçları etkileyebilen PS içerir. Trombositler, EDTA içeren bir tamponlama maddesi kullanılarak ve 200 g'de santrifüj edilerek yıkanabilir.
5) Kapağı açmadan önce reaktifi kısa bir süre santrifüjleyin ve kapağın iç duvarındaki sıvıyı tüpün tabanına doğru dökün, böylece kapak açıldığında sıvı sıçraması önlenir.
6) Annexin V-EGFP ve PI ışığa duyarlı maddelerdir, bu nedenle çalışma sırasında ışıktan kaçınınız.
7) Sadece araştırma amaçlıdır!

Talimatlar

Deney tasarımı
Boş tüp: Voltaj regülasyonu için Annexin V-EGFP ve PI Boyama Solüsyonu içermeyen negatif kontrol hücreleri kullanıldı.
Tek boyalı tüpler: Kompanzasyonu düzenlemek için sadece Annexin V-EGFP ile desteklenen pozitif kontrol hücreleri kullanıldı.
Tespit tüpü: Hücreler Annexin V-EGFP ve PI Boyama Çözeltisi ile muamele edildi. Deneysel veriler boş tüp ve tek boya tüpünün parametreleri ayarlanarak elde edildi.
1.1 Numune boyama
1) süspansiyon hücresi: Hücreler 4 °C’de 5 dakika 300 g’de santrifüj edilerek toplandı.
Yapışık hücre: EDTA'sız tripsin ile sindirimden sonra hücreler 4 °C'de 5 dakika boyunca 300 g'de santrifüj edilerek toplandı. Yanlış pozitifleri önlemek için tripsin sindirim süresi çok uzun olmamalıdır.
2) Hücreler önceden soğutulmuş PBS ile iki kez (her seferinde 300 g'de) yıkandı ve 4 ℃'de 5 dakika santrifüj edildi.
3) Hücreler 1×Bağlayıcı Tampon ile resüspanse edildi ve konsantrasyon 1~5 ×106/mL'ye ayarlandı.
4) 5 mL akış sitometri tüplerine 100 μL hücre süspansiyonu eklendi, üzerlerine 5 μl Annexin V-EGFP eklendi ve hücreler karıştırılarak oda sıcaklığında ışık altında 5 dakika inkübe edildi.
5) 10 μl PI Solüsyonu ve 400 μl PBS eklenerek hemen boyama işlemi gerçekleştirildi.
[Notlar]: Apoptozu tespit etmek için akış sitometrisi kullanıldığında, PI zamandan büyük ölçüde etkilenir ve çok uzun süre geçmesi PI boyamasında artışa yol açacağından, akış sitometrisi 1 saat içinde tamamlanmalıdır.
1.2 Akış sitometrisi analizi
EGFP'nin maksimum uyarılma dalga boyu 488 nm ve maksimum emisyon dalga boyu 507 nm idi; PI-DNA kompleksinin maksimum uyarılma dalga boyu 535 nm ve maksimum emisyon dalga boyu 615 nm idi. Analiz için CellQuest gibi yazılımlar kullanıldı ve iki renkli nokta grafiği çizildi, EGFP apsis ve PI ordinattır. Örnek başına 10.000 olay toplayın. Tipik bir deneyde, hücreler üç alt gruba ayrılabilir, canlı hücreler sadece çok düşük yoğunluklu arka plan floresansına sahiptir, erken apoptotik hücreler sadece güçlü yeşil floresansa sahiptir ve geç apoptotik hücreler yeşil ve kırmızı floresan çift boyamaya sahiptir.