Annexin V-Alexa Fluor488/PI apoptozis tespit kitinin tespit prensibi şu şekildedir: normal canlı hücrelerde fosfotidilserin (PS) hücre zarının iç tarafında bulunur, ancak erken apoptotik hücrelerde PS hücre zarının iç tarafından hücre zarının yüzeyine döner ve hücre dışı ortama maruz kalır. Annexin-V bir Ca²⁺ Molekül ağırlığı 35-36KD olan, PS'ye yüksek afiniteyle bağlanan ve hücrenin dışında bulunan fosfatidilserin aracılığıyla erken apoptotik hücrelerin hücre zarına bağlanan, -bağımlı fosfolipit bağlayıcı protein.
Ek olarak, hayatta kalan erken hücreleri nekrotik veya geç apoptotik hücrelerden ayırt etmek için Propidium İyodür (PI) sağlanır. PI, normal hücrelerin veya erken apoptotik hücrelerin sağlam hücre zarından geçemeyen ancak geç apoptotik ve nekrotik hücrelerin hücre zarından geçebilen ve çekirdeği kırmızı yapabilen bir nükleik asit boyasıdır. Bu nedenle, Annexin V, PI ile birleştirildiğinde, PI canlı hücrelerden dışlanmıştır (Annexin V^-/Pİ^-) ve erken apoptotik hücreler (Annexin V)⁺/Pİ^-). Buna karşılık, geç apoptotik ve nekrotik hücreler Alexa Fluor488 ve PI (Annexin V) için çift pozitifti⁺/Pİ⁺).

Ürün Bileşenleri

Nakliye ve Depolama

Bileşenler buz torbasıyla birlikte gönderilmekte olup -20°C'de 1 yıl saklanabilmektedir.

Dikkat Edilmesi Gerekenler

1) Apoptozis hızlı bir süreç olduğundan, örneklerin boyama sonrası 1 saat içinde analiz edilmesi önerilir.
2) Yapışık hücreler için sindirim kritik bir adımdır. Sindirim solüsyonunda EDTA kullanmayın çünkü EDTA, Annexin V'nin PS'ye bağlanmasını etkileyebilir.
3) Örnek kandan alınmışsa, kandan trombositleri çıkardığınızdan emin olun. Çünkü trombositler, Annexin V'e bağlanabilen ve sonuçları etkileyebilen PS içerir. EDTA içeren bir tamponlama maddesi kullanılabilir ve trombositler 200 g'da santrifüjleme ile yıkanabilir.
4) Kapağı açmadan önce reaktifi kısa bir süre santrifüjleyin ve kapağın iç duvarındaki sıvıyı tüpün tabanına doğru dökün, böylece kapak açıldığında sıvı sıçraması önlenir.
5) Annexin V-Alexa Fluor488 ve PI ışığa duyarlı maddelerdir ve elleçleme sırasında ışıktan uzak tutulmalıdır.
6) Sadece araştırma amaçlıdır!

Talimatlar

1.1 Örnek boyama
1.a) süspansiyon hücresi: Hücreler 4°C'de 5 dakika boyunca 300 g'de santrifüj edilerek toplandı.
b) yapışık hücre: EDTA'sız tripsin ile sindirimden sonra hücreler 4 °C'de 5 dakika boyunca 300 g'de santrifüj edilerek toplandı. Yanlış pozitifleri önlemek için tripsin sindirim süresi çok uzun olmamalıdır.
2. Hücreler 4 °C'de önceden soğutulmuş PBS ile iki kez yıkandı (her seferinde 300 g) ve 4 °C'de 5 dakika santrifüj edildi.
3. Hücreler 250 μL 1×Bağlayıcı Tampon eklenerek resüspanse edildi ve konsantrasyon 1×106/mL’ye ayarlandı.
4. 5 mL akış sitometrisi tüpüne 100 μL hücre süspansiyonu eklendi, 5 μL Annexin V-Alexa Fluor 488 ve 10 μL PI eklendi ve yavaşça karıştırıldı.
5. Reaksiyon ışıktan uzak tutularak oda sıcaklığında 15 dakika bekletildi.
6. 400 μL 1×Bağlayıcı Tampon eklendi, karıştırıldı ve örnekler 1 saat içerisinde akış sitometrisi ile tespit edildi.
[Notlar]: Hücre yıkama sırasında hücre kaybını önlemek için, sıvıyı aspire etmek için küçük bir Uç kullanılabilir.
1.2 Akış sitometrisi analizi
Alexa Fluor488'in maksimum uyarım dalga boyu 488 nm ve maksimum emisyon dalga boyu 519 nm'dir; PI-DNA kompleksinin maksimum uyarım dalga boyu 535 nm ve maksimum emisyon dalga boyu 615 nm'dir. CellQuest ve diğer yazılımlar, Alexa Fluor488'i apsis ve PI'yi ordinat olarak kullanarak iki renkli bir nokta grafiğini analiz etmek ve çizmek için kullanıldı. Örnek başına 10.000 olay toplayın.
1.3 Floresan mikroskopi analizi
1) Annexin V-FITC/PI ile çift boyanmış hücre süspansiyonundan bir damlayı lam üzerine damlatın ve hücreleri bir lamel ile örtün.
2) İki renkli filtreli floresan mikroskobu altında gözlendi. Annexin V-FITC floresan sinyali yeşil, PI floresan sinyali ise kırmızıydı.