Hücreler apoptozise uğradığında, nükleozomlar arasındaki genomik DNA'yı kesen endonükleaz enzimlerini aktive ederler. Apoptoz sırasında DNA çıkarıldıktan sonra, 180-200 bp'lik bir DNA merdiveni bulunabilir.
TUNEL (TdT aracılı dUTP Nick End Etiketleme) Apoptozis tespit kiti (Alexa Fluor 640), doku hücrelerinin geç apoptotik sürecinde nükleer DNA parçalanmasını tespit etmek için kullanılabilir. Prensip, Terminal Deoksinükleotidil Transferaz (TdT) etkisi altında Alexa Fluor 640-12-DUTP'nin genomik DNA kırılması sırasında açığa çıkan 3´ -hidroksil (3´-OH) Terminaline dahil edilmesidir. Bu nedenle, floresan mikroskopisi veya akış sitometrisi ile tespit edilebilir. Alexa Fluor 640, yüksek stabiliteye ve güçlü parlaklığa sahip kırmızı bir floresan boyadır.
Bu kit geniş bir uygulama alanına sahip olup, dondurulmuş veya parafin kesitlerde, ayrıca kültürlenmiş yapışık veya süspanse edilmiş hücrelerde apoptozu tespit etmek için kullanılabilir.

Ürün Bileşenleri

Nakliye ve Depolama

Bileşenler buz torbasıyla birlikte gönderilmekte olup -20°C'de 1 yıl saklanabilmektedir.

Dikkat Edilmesi Gerekenler

1. Hücreleri yıkamak için kendi PBS'nizi, tabletleri kapatmak için bir anti-floresans söndürme solüsyonunu ve sabitlemek için %4 paraformaldehiti hazırlamanız gerekir. Lökositlerin uzun süre kültürlenmesi gerekebilir.
2. Sadece araştırma amaçlıdır!

Talimatlar

1. Numune hazırlama
1.1 Parafin gömülü doku kesitleri
1.1.1.Parafin doku kesitleri oda sıcaklığında 5 dakika ksilen içerisinde bekletildi ve parafinin iyice uzaklaştırılması için işlem bir kez daha tekrarlandı.
1.1.2.Kesitleri oda sıcaklığında 5 dakika %100 etanolde bekletin ve işlemi bir kez daha tekrarlayın.
1.1.3. Oda sıcaklığında, numuneler her seferinde 3 dakika süreyle gradyan etanol (%90, 80, 70) ile ıslatıldı.
1.1.4. Kesitleri PBS ile nazikçe durulayın ve filtre kağıdıyla cam slaytlardaki numunenin etrafındaki fazla sıvıyı dikkatlice kurulayın. Bu durumda, parafin kalemi veya hidrofobik kalem, numunenin etrafındaki numune dağılımının ana hatlarını çizmek için kullanılabilir; bu, aşağı akış geçirgenlik işleme ve terazi etiketleme işlemi için uygundur. Numunenin deney sırasında kurumasına izin vermeyin. Numuneyi ıslak tutmak için işlenmiş numuneyi ıslak kutuya koyun.
1.1.5.2 mg/mL Proteinase K çözeltisi, 20 μg/mL'lik son konsantrasyona ulaşmak için 1:100 oranında PBS ile seyreltildi.
1.1.6. Her bir örneğe 20 μg/mL konsantrasyonda 100 μL Proteinase K solüsyonu, numuneyi tamamen kaplayacak şekilde eklendi ve oda sıcaklığında 20 dakika inkübe edildi.
[Notlar]: Proteinase K, dokuların ve hücrelerin sonraki adımlarda boyama reaktiflerine geçirgen hale gelmesine yardımcı olur. Çok uzun inkübasyon süresi, sonraki yıkama adımlarında doku kesitlerinin taşıyıcı plakadan düşme riskini artıracaktır; çok kısa inkübasyon süresi ise yetersiz geçirgenlik işlemine neden olabilir ve etiketleme verimliliğini etkileyebilir. Daha iyi sonuçlar elde etmek için, Proteinase K'nin inkübasyon süresini optimize etmek gerekebilir.
1.1.7.Örneği 2-3 kez PBS solüsyonuyla durulayın, fazla sıvıyı nazikçe alın ve sıvıyı dikkatlice slayt üzerindeki örneğin etrafına filtre kağıdıyla bastırın. İşlenen örnek, örneğin nemli kalması için ıslak bir kutuya yerleştirilir.
1.2 Dokunun dondurulmuş kesiti
1.2.1. Dondurulmuş kesitleri çıkarın ve oda sıcaklığına geri getirin. Slaytlar %4 paraformaldehit solüsyonuna (PBS'de çözülmüş) daldırıldı ve sabitlendi ve oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edildi.
1.2.2. Fazla sıvıyı nazikçe alın ve filtre kağıdı kullanarak cam slayt üzerindeki numunenin etrafındaki fazla sıvıyı dikkatlice emdirin.
1.2.3. Lamlar PBS solüsyonuna daldırılıp oda sıcaklığında 15 dakika inkübe edildikten sonra toplamda 2 kez tekrar PBS ile yıkandı.
1.2.4. Fazla sıvıyı nazikçe çıkarın ve numunenin etrafındaki fazla sıvıyı çıkarmak için cam slaydı dikkatlice filtre kağıdıyla kurulayın. Bu durumda, numunenin etrafındaki numune dağılımının ana hatlarını çizmek için parafin kalemi veya hidrofobik kalem kullanılabilir; bu, aşağı akış geçirgenlik işleme ve terazi etiketleme işlemi için uygundur. Deney sırasında numunenin kurumasına izin vermeyin ve numuneyi ıslak tutmak için işlenmiş numuneyi ıslak kutuya koyun.
1.2.5. 2 mg/mL Proteinase K çözeltisi, 20 μg/mL'lik son konsantrasyona ulaşmak için 1:100 oranında PBS ile seyreltildi.
1.2.6. Her bir örneğe 20 μg/mL konsantrasyonda 100 μL Proteinase K solüsyonu, numuneyi tamamen kaplayacak şekilde eklendi ve oda sıcaklığında 10 dakika inkübe edildi.
[Notlar]: Proteinase K, dokuların ve hücrelerin sonraki adımlarda boyama reaktiflerine geçirgen olmasına yardımcı olur. Çok uzun inkübasyon süresi, sonraki yıkama adımlarında doku kesitlerinin taşıyıcı plakadan düşme riskini artıracaktır; çok kısa inkübasyon süresi ise yetersiz geçirgenlik işlemine neden olabilir ve etiketleme verimliliğini etkileyebilir. Daha iyi sonuçlar elde edilememişse Proteinase K inkübasyon süresinin optimize edilmesi gerekebilir.
1.2.7. Numuneyi PBS solüsyonu içeren açık bir beherde 2-3 kez durulayın.
[Notlar]: Temizleme aşamasında numune soyulmasında kayıp yaşanmaması için şişenin yıkanmaması, bunun yerine cam slaytların temizlik amacıyla 2-3 kez PBS solüsyonuna batırılması önerilir.
1.2.8. Fazla sıvıyı nazikçe alın ve filtre kağıdı kullanarak slayt üzerindeki numunenin etrafındaki sıvıyı dikkatlice emdirin.İşlenen numune, numunenin nemini korumak için ıslak bir kutuya yerleştirilir.
1.3 Hücre tarama sayfasının hazırlanması
Yapışkan hücreler Lab-Tek Chamber Slaytları üzerinde kültürlendi. Apoptozis indüksiyon tedavisinden sonra slaytlar iki kez PBS ile yıkandı.
1.4 Hücre yaymalarının hazırlanması (Örnek olarak poli-lizin kaplı slaytlar ele alınmıştır)
1.4.1. Hücreler yaklaşık 2x107 hücre/mL konsantrasyonda PBS'de yeniden süspanse edildi, hücre süspansiyonunun 50-100 μL'si poli-lizin kaplı lamlara aspire edildi ve hücre süspansiyonu temiz bir lamla nazikçe açıldı.
1.4.2. Hücreler fiksasyona tabi tutuldu ve slaytlar PBS içinde %4 oranında taze hazırlanmış paraformaldehit içeren bir boyama tankına daldırıldı ve 25 dakika boyunca 4 °C'de tutuldu.
1.4.3. Slaytlar yıkandı, PBS'ye daldırıldı ve oda sıcaklığında 5 dakika bekletildi. Tekrar PBS ile yıkayın.
1.4.4. Fazla sıvıyı nazikçe çıkarın ve numunenin etrafındaki fazla sıvıyı çıkarmak için cam slaydı dikkatlice filtre kağıdıyla kurulayın. Bu durumda, numunenin numune etrafındaki dağılımını ana hatlarıyla belirtmek için bir parafin kalemi veya hidrofobik kalem kullanılabilir; bu, aşağı akış geçirgenlik işlemeyi kolaylaştırır ve etiketleme işlemlerini dengeler. Deney sırasında numunenin kurumasına izin vermeyin ve numuneyi ıslak tutmak için işlenmiş numuneyi ıslak kutuya koyun.
1.4.5. 2 mg/mL Proteinase K çözeltisi, 20 μg/mL'lik son konsantrasyona ulaşmak için 1:100 oranında PBS ile seyreltildi.
1.4.6. Her bir örneğe 20 μg/mL konsantrasyonda 100 μL Proteinase K çözeltisi eklenerek tamamen kaplandı ve oda sıcaklığında 5 dakika inkübe edildi (geçirgenlik işlemi için PBS'de hazırlanmış %0,2'lik Triton X-100 çözeltisine de daldırılıp oda sıcaklığında 5 dakika inkübe edilebilir).
[Notlar]: Proteinase K, dokuların ve hücrelerin sonraki adımlarda boyama reaktiflerine geçirgen olmasına yardımcı olur. Çok uzun inkübasyon süresi, sonraki yıkama adımlarında doku kesitlerinin taşıyıcı plakadan düşme riskini artıracaktır; çok kısa inkübasyon süresi ise yetersiz geçirgenlik işlemine neden olabilir ve etiketleme verimliliğini etkileyebilir. Daha iyi sonuçlar elde edilememişse Proteinase K inkübasyon süresinin optimize edilmesi gerekebilir.
1.4.7. Örneği 2-3 kez PBS ile durulayın, fazla sıvıyı nazikçe alın ve sıvıyı dikkatlice filtre kağıdıyla slayt üzerindeki örneğin etrafına yayın. İşlenen örnekler ıslak bir kutuya yerleştirildi.
2. Pozitif kontrollerin DNase tedavisine yönelik adımlar
Numunenin nüfuz etmesinden sonra, hücreler pozitif kontrol slaytları hazırlamak için DNase I ile muamele edildi. Bu işlem genellikle hücrelerin çoğunun yeşil floresans gösterecek şekilde işlendi.
[Notlar]: Hareketsizleştirilmiş hücrelerin Dnaz I ile tedavisi kromozomal DNA'nın kırılmasına neden olur ve etiketlenebilen birçok 3'-uçlu DNA üretir.
2.1. 10×DNase I Tamponunu 1:10 oranında deiyonize su ile seyreltin (her örnek için 200 µL 1×DNase I Tamponu gereklidir, yani seyreltme için 20 µL 10×DNase I Tamponu ve 180 µL deiyonize su gereklidir). Geçirgen örneğe 100 µl'lik bir damla eklendi ve oda sıcaklığında 5 dakika inkübe edildi. Kalan 100 μL 1×DNase I Tamponuna 1 μL DNase I (1U/μL) ekleyerek 10 U/mL'lik son konsantrasyona ulaşın.
2.2.Sıvı yavaşça alındı, ardından 10 U/mL DNase I içeren 100 μL tampon eklendi ve oda sıcaklığında 10 dakika inkübe edildi.
2.3.Fazla sıvıyı almak için slayda vurun ve slaydı deiyonize su içeren bir boya tankında 3-4 kez iyice yıkayın.
[Notlar]: Pozitif kontrol slaytları için ayrı bir boyama tankı kullanılmalıdır, aksi takdirde pozitif kontrol slaytlarındaki kalıntı DNase I, deneysel slaytlarda yüksek bir arka plan oluşturabilir.
3. Etiketleme ve Tespit
3.1.Dengeleme Tamponu (5 x Dengeleme Tamponu), 1:5 oranında deiyonize su ile seyreltilir (her numune için 100 μL 1 x Dengeleme Tamponu gereklidir).
3.2. Alanı tamamen dengeye getirmek için her numuneye Dengeleme Tamponu (100 μL 1×Dengeleme Tamponu) eklendi ve oda sıcaklığında 10-30 dakika inkübe edildi. Alternatif olarak, slaytların örneği dengeye getirmediğinden emin olmak için 1 x Dengeleme Tamponu içeren bir küvete kaydırın. Hücreleri dengelerken Alexa Fluor 640-12-dUTP Etiketleme Karışımını buz üzerinde çözdürün ve Tablo 1'e göre tüm deneyler ve isteğe bağlı pozitif kontrol reaksiyonları için yeterli TdT inkübasyon tamponu hazırlayın. 5 cm2'den daha az alana sahip standart bir reaksiyon için hacim 50 μl'dir ve 50 μL, gerekli TdT inkübasyon tamponunun toplam hacmini belirlemek için deneysel ve pozitif kontrol reaksiyonlarının sayısıyla çarpılır. Daha büyük yüzey alanlarına sahip numuneler için reaktif hacmi orantılı olarak artırılabilir.

Tablo 1. Deneyler ve isteğe bağlı pozitif kontrol reaksiyonları için hazırlanan TdT inkübasyon tamponları

[Negatif kontrol sistemi]: TdT enzimi içermeyen bir kontrol inkübasyon tamponu hazırlandı ve TdT enzimi ddH2O ile değiştirildi.
3.3. 100 μL 1×Equilibration Buffer'ın çoğu dengelenmiş alanın etrafındaki emici kağıtla yıkandı ve ardından 50 μLTdT inkübasyon Buffer'ı 5 cm2'lik hücre alanına eklendi. Hücrelerin kurumasına izin vermeyin. Bundan sonra, slayt ışıktan korunmalıdır.
3.4. Reaktiflerin eşit şekilde dağılmasını sağlamak için hücrelerin üzerine plastik bir lamel yerleştirin ve ıslak kutunun altına suyla nemlendirilmiş bir kağıt havlu koyun. Slaytlar ıslak bir kutuya yerleştirildi ve 37 °C'de 60 dakika inkübe edildi. Islak kutuyu ışıktan korumak için alüminyum folyoya sarın.
[Notlar]: Plastik kapak camı kullanımdan önce ikiye kesilebilir. Kapak camının kenarını kolayca çıkarmak ve işlemek için katlayın.
3.5. Plastik lamelleri çıkarıldı ve kesitler oda sıcaklığında PBS solüsyonunda 5 dakika inkübe edildi. Daha sonra kesitler iki kez taze PBS ile yıkandı.
3.6. Filtre kağıdı kullanarak numunenin etrafını ve arkasını PBS solüsyonuyla hafifçe silin.
[Notlar]: Arka planı azaltmak için, slaytlar PBS ile bir kez yıkandıktan sonra, %0,1 Triton X-100 ve 5 mg/mL BSA içeren PBS ile 3 kez, her seferinde 5 dakika olmak üzere yıkanabilir, böylece serbest, tepkimeye girmemiş belirteçler berrak ve temiz olabilir.
3.7. Örnekler bir boyama tankında boyandı ve slaytlar karanlıkta PI solüsyonu (1 μg/mL, taze hazırlanmış ve PBS ile seyreltilmiş) içeren bir boyama tankına daldırıldı ve oda sıcaklığında 5 dakika bekletildi. (İsteğe bağlı) Örnekler bir boyama tankında boyandı ve slaytlar karanlıkta DAPI solüsyonu (2 μg/mL, taze hazırlanmış ve PBS ile seyreltilmiş) içeren bir boyama tankına daldırıldı ve oda sıcaklığında 5 dakika bekletildi.
3.8.Örneği yıkayın, slaydı deiyonize suya daldırın ve oda sıcaklığında 5 dakika bekletin. Toplam üç yıkama için iki kez tekrarlayın.
3.9. Lam üzerindeki fazla su kurutuldu ve numunenin nemli kalması için numune alanına 100 μl PBS eklendi.
3.10. Örnekler hemen bir floresan mikroskobu altında analiz edildi, Alexa Fluor 640 kırmızı floresansı 620 nm'de tespit edildi ve mavi DAPI 460 nm'de gözlendi. DAPI hem apoptotik hem de apoptotik olmayan hücreleri maviye boyayabilirdi ve yalnızca apoptotik çekirdeklerde Alexa Fluor 640-12-dUTP dahil edildi ve kırmızı floresansı lokalize etti. Gerekirse, slaytlar karanlıkta 4 °C'de bir gece saklanabilir.
4. Süspansiyon hücreleri akış sitometrisi ile tespit edildi
4.1. 3~5×106 hücre, 4 °C'de santrifüjleme (300×g) yoluyla iki kez PBS ile yıkandı, 10 dakika boyunca 4 °C'de 300 g'de santrifüjlendi ve daha sonra 0,5 mL PBS'de yeniden süspanse edildi.
4.2. Hücreler fiksasyona tabi tutuldu ve PBS’de hazırlanmış %1’lik paraformaldehit solüsyonundan 5 mL eklenerek 20 dakika buz üzerinde bekletildi.
4.3. Hücreler 10 dakika boyunca 4 °C'de 300 × g'de santrifüj edildi ve üstteki sıvı çıkarıldı ve 5 mL PBS'de yeniden süspanse edildi. Yıkama bir kez tekrarlandı ve hücreler 0,5 mL PBS ile yeniden süspanse edildi.
4.4. Hücreler geçirgenleştirildi ve 5 mL buzla önceden soğutulmuş %70 etanol eklendi ve -20 °C'de 4 saat inkübe edildi. Hücreler -20℃'de %70 etanolde bir hafta saklanabilir veya hücreler PBS'de hazırlanan %0,2 Triton X-100 çözeltisiyle geçirgen hale getirilebilir ve oda sıcaklığında 5 dakika saklanabilir.
4.5. Hücreler 10 dakika boyunca 300 × g'de santrifüj edildi ve 5 mL PBS'de yeniden süspanse edildi. Santrifüjleme tekrarlandı ve 1 mL PBS'de yeniden süspanse edildi.
4.6. 2 × 106 hücreyi 1,5 ml'lik mikrosantrifüj tüpüne aktarın.
4.7. Dengeleme 10 dakika boyunca 300 × g'de santrifüj edildi ve üst sıvı çıkarıldı ve 80 μL 1 × Dengeleme Tamponu ile yeniden süspanse edildi. Oda sıcaklığında 5 dakika inkübe edin.
4.8. Hücreler dengelenirken Alexa Fluor 640-12-dUTP Etiketleme Karışımı buz üzerinde eritildi ve tüm reaksiyonlar için yeterli miktarda TdT inkübasyon tamponu Tablo 1'e göre hazırlandı. 2 × 106 hücrelik standart bir reaksiyon için hacim 50 μL idi ve 50 μL, reaksiyon sayısıyla çarpılarak gerekli TdT inkübasyon tamponunun toplam hacmi belirlendi.
4.9. Hücreler 10 dakika boyunca 300 × g'de santrifüj edildi, üstteki sıvı uzaklaştırıldı ve çökelti 50 μL TdT inkübasyon tamponunda yeniden süspanse edildi ve ışıktan korunarak 37℃'de 60 dakika inkübe edildi. Hücreler her 15 dakikada bir mikropipet ile nazikçe yeniden süspanse edildi.
4.10. Reaksiyon 1 mL 20 mM EDTA eklenerek ve mikropipet ile hafifçe karıştırılarak sonlandırıldı.
4.11. 10 dakika boyunca 300 g'de santrifüjlemeden sonra, üstteki sıvı atıldı ve çökelti, 5 mg/mL BSA içeren PBS'de hazırlanan 1 mL %0,1 Triton X-100 çözeltisinde yeniden süspanse edildi. Çözelti bir kez tekrarlandı ve toplamda iki kez yıkandı.
4.12. Hücreler akış sitometrisi ile analiz edildi ve Alexa Fluor 640'ın 620 nm'deki kırmızı floresansı ölçüldü.