Talimatlar

1. Deney öncesi hazırlıklar

1) Deneyde kullanılacak gerekli reaktifleri ve malzemeleri hazırlayın.

2）Uygunluğunu onaylayın qPCR cihazı

Bu kit aşağıdaki qPCR cihaz tiplerinde kullanılabilir:

1. Biyo-Rad: CFX96
2. Thermo Scientific: 7500 Gerçek Zamanlı PCR Sistemi；QuantStudio™5；
3. Deney yöntemi

1) DNA Çıkarımı

Kullanmanızı öneririz ' Manyetik Kalıntı DNA Örnek Hazırlama Kiti' (Cat#18461ES için manuel çıkarma ve Cat#18462ES için otomatik çıkarma) için DNA çıkarımı, Sen olabilmek ziyaret etmek ' http:/www.yeasenbiotech.com '  için ,

Detaylı bilgi ve satın alma.

Kit (Cat#40619ES) bir dahili kontrol (IC) içerir. IC'yi DNA ekstraksiyonundan önce numunelere eklerseniz, tüm süreci (DNA ekstraksiyonu ve qPCR reaksiyonu dahil) doğrulayabilir. IC'yi qPCR ana karışımına eklerseniz

doğrudan, IC yalnızca qPCR kontrolü olarak işlev görecektir.

2)qPCR Karışımının hazırlanması

1. Pozitif kontrol (PCS), Şablonsuz kontrol (NTC), Negatif içeren örnek miktarına göre  reaksiyon sayısını hesaplamak için kontrol solüsyonu (NCS) ve Testsample (TS). 2 reaksiyonu paralel olarak hazırlayın

her numune genel olarak.

* PCS：Olumlu kontrol çözüm；NTC：Hayır şablon kontrol；NCS：Olumsuz kontrol çözüm；TS：Test örnek. Orada dır HAYIR ihtiyaç ile rol yapmak

, örnek çıkarma için Bilgisayarlar Ve NTC, ancak NCS Ve TS vardır ihtiyaç duyulmaktadır.

Tepkime kuyuları（M1）=（1×NCS + Hayır×TS） ×2

Tepkime kuyuları（M2）=（1×PCS + 1×NTC） ×2

Tepkime kuyuları（M3）=（1×PCS + 1×NTC+ N×TS） ×2

1. Deney tasarımına ve aşağıdaki tablolara göre gerekli miktarda reaktifi buz üzerinde önceden çözdürün.
2. qPCR Karışımı miktarını reaksiyon sayısına göre hesaplayın. Lütfen, kitin ürün serbest bırakma gibi GMP faaliyetleri için kullanılacağını unutmayın, hazırlık için Tablo 1 ve 2'yi kullanmanızı öneririz; kit olacak Sadece araştırma için kullanılır ve değerlendirmeden sonra çıkarmadan önce IC eklemeye gerek yoktur, o zaman Tablo 3'ü takip edin

hazırlık. Lütfen tüm M1, M2 ve M3'ün vardır ihtiyaç duyuldu olmak hazırlanmak.

Tablo 1 M1 için qPCR Karışım sistemi

*Bu yapılandırma sistem içinde Masa 1'dir temelli Açık , öncül O IC dır eklendi önce çıkarma için ikisi birden NCS Ve TS, yani BT dır Olumsuz gerekli

ile eklemek IC Ne zaman qPCR Karışım hazırlık. IC ekleme yöntem önce çıkarma: İlk olarak seyreltin IC ile 20 kez ile DNA seyreltici ve eklemek 1μL

seyreltilmiş IC içine her biri 100μL test örnek için , daha öte çıkarma.

**Bu kit yapmak Olumsuz içermek ROX Referans Boya. Eğer ROX referans boya dır ihtiyaç duyulan için , Gerçek Zaman PCR amplifikatörler O Sen vardır şu anda kullanarak, 50×ROX Referans Boya (Kat#10200ES) tavsiye edilen için kullanmak. İçinde Bu dava, eklendi hacim dır 0,8μL, gibi gösterilen içinde Masa 1. Eğer kullanarak diğer

markalar ile ilgili ROX ürünler lütfen bahsetmek ile onların talimatlar için ROX ek.Eğer HAYIR ROX referans boya dır gerekli, eklendi hacim dır 0 μL.

Tablo 2 M2 için qPCR Karışım sistemi

*Bu yapılandırma sistem içinde Masa 2 dır temelli Açık , öncül O IC dır Olumsuz eklendi içinde Bilgisayarlar Ve NTC önce çıkarma, Bu yüzden IC ihtiyaçlar ile olmak eklendi sırasında qPCR Karışım hazırlık. IC ekleme yöntem sonrasında çıkarma: Seyreltik IC ile 100 kez ile DNA seyreltici Ve eklemek 1μL seyreltilmiş IC içine

her biri qPCR Karışım sistem.

**Bu kit yapmak Olumsuz içermek ROX Referans Boya. Eğer ROX referans boya dır ihtiyaç duyulan için , Gerçek Zaman PCR amplifikatörler O Sen vardır şu anda kullanarak, 50×ROX Referans Boya (Kat#10200ES) tavsiye edilen için kullanmak. İçinde Bu dava, eklendi hacim dır 0,8μL, gibi gösterilen içinde Masa 1. Eğer kullanarak diğer

markalar ile ilgili ROX ürünler lütfen bahsetmek ile onların talimatlar için ROX ek olarak. Eğer HAYIR ROX referans boya dır gerekli, eklendi hacim dır 0 μL.

Tablo 3 M3 için qPCR Karışım sistemi

*Bu yapılandırma sistem içinde Masa 3'tür temelli Açık , öncül O IC dır Olumsuz eklendi ile örnekler önce çıkarma, yani IC ihtiyaçlar ile olmak eklendi    sırasında qPCR Karışım hazırlık. IC ekleme yöntem sonrasında çıkarma: Seyreltik IC ile 100 kez ile DNA seyreltici Ve eklemek 1μL içine her biri qPCR Karışım

sistem.

**Bu kit yapmak Olumsuz içermek ROX Referans Boya. Eğer ROX referans boya dır ihtiyaç duyulan için , Gerçek Zaman PCR amplifikatörler O Sen vardır şu anda kullanarak, 50×ROX Referans Boya (Kat#10200ES) tavsiye edilen için kullanmak. İçinde Bu dava, eklendi hacim dır 0,8μL, gibi gösterilen içinde Masa 1. Eğer kullanarak diğer

markalar ile ilgili ROX ürünler lütfen bahsetmek ile onların talimatlar için ROX ek olarak. Eğer HAYIR ROX referans boya dır gerekli, eklendi hacim dır 0 μL.

3) Şablonlar ekleniyor

1. qPCR Karışımını yeterli çalkalama ile karıştırın, düşük hızda santrifüjleyin ve kapaktaki kalan sıvıyı toplayın.

dibine tüp.

1. 20 ekle Her reaksiyon tüpüne/kuyuya μL qPCR Karışımı ekleyin. Lütfen her birine karşılık gelen qPCR Karışımını eklemeyi unutmayın

Örnek tüplerini kontrol edin ve hataların oluşmasını önleyin.

1. qPCR Mix'i içeren tüp/kuyulara Şablonlar ekleyin. Şablonların eklenmesi için Tablo 4'e bakın.

Masa 4 Şablon ekleme

*DNA ekstraksiyonu için NCS şablonu olarak DNA Seyreltme Tamponu (40619-E) kullanılmasını öneriyoruz.

**Bu toplam tepki hacim içinde her biri tüp/kuyu dır 40 μL.

***Kapak , tüp kapak veya , plaka film. İçin kaçınmak etkileyen , floresans sinyal lütfen okuyun almak bakım Olumsuz ile işaret , tüp kapak veya film

veya eşit ovmak , film tekrar tekrar ile A kazıyıcı.

****Santrifüj , tepki tüp veya plaka kısaca de Düşük hız sonrasında şablonlar ekleniyor. Sonrasında yeterli sallama Ve karıştırma, tekrarlama santrifüj

de Düşük hız ile TOPLAMAK , sıvı itibaren , kapak veya duvar ile , alt. Kaçının kabarcıklar Ne zaman operasyon. temel çizgi irade olmak etkilenen eğer , karışım

dır Olumsuz karışık iyi, yani Bu adım dır çok önemli ile A iyi deney sonuç.

4）qPCR programlarının ayarlanması

1. Program dosyası Ayarları

Örnek (7500 Gerçek Zamanlı PCR Sistemi cihazı ve Gerçek Zamanlı PCR Yazılımı v2.4):

Enstrüman tipi：7500 (96 Kuyu)

Deney türü：Miktarlandırma-Standart Eğrisi；

Kimya：Taqman® Reaktifleri

Rampa Hızı：Standart (~bir koşuyu tamamlamak için 2 saat)

1. Hedef kanal ayarları

İçinde "Tanımlamak Hedefler Ve Örnekler" ile ilgili "Plaka Kurmak", yaratmak A Hedef 1 kanal (AİLE), seçme AİLE gibi , raporlama floresan grubu ve MGB veya hiçbiri söndürme olarak floresans Grup. Yaratmak A Hedef 2 kanal (VIC), seçme , raporlama floresans grup gibi VİK Ve , söndürme floresans grup gibi hiçbiri. İçinde "Atamak Hedefler Ve Örnekler" ile ilgili "Plaka Kurmak", eğer HAYIR ek olarak ROX boya dır eklendi, seç "hiçbiri"; Eğer bir ek olarak ROX dır eklendi, seç

ROX.

1. Standart amplifikasyon programı Ayarları

Tablo 5 Standart amplifikasyon programı Ayarları

1. Temel ve eşik belirleme:

İlke ile ilgili temel çizgi ayarlama: kullanmak , otomatik temel çizgi genel olarak. Eğer ihtiyaç ile ayarlamak içinde manuel, seçmek , döngü Üstel büyümeden önce başlangıç ​​döngüsü olarak periyodu seçin ve dalgalanma bölgesinden kaçının ilk floresans toplama. En erken üstel amplifikasyon örneğinin Ct'sinden 1-2 döngü önce olan döngüyü seçin

son nokta.

İlke ile ilgili eşik ayarlama: genellikle otomatik eşiği kullanın. Manuel olarak ayarlamanız gerekirse, eşik gerekir olmak ayarlamak daha yüksek hariç , Negatif örnek veya , temel çizgi gürültü, onun genel olarak ayarlamak eşik içinde , geç

aşaması Her tünel için üstel amplifikasyon, göreceli olarak bağımsız ve uygun eşik değerine ihtiyaç vardır.

5) Sonuç Analiz

1. PCS, NTC ve NCS için sonuç kararı:

IC eklenirse: her kontrol örneğinin spesifikasyonu şu şekilde olmalıdır: Tablo 6'da belirtilenler karşılandı:

Masa 6 Sonuç yargı ile ilgili PCS, NTC Ve NCS

IC eklenmezse: her kalite kontrol örneği Tablo 6'daki FAM sinyal kolonunun spesifikasyonunu karşılamalı ve hiçbir

analiz etmem gerekiyor VIC kanalı.

1. TS için sonuç yargısı

Ön koşul: BT dır olup olmadığını belirlemek için gerekli Bilgisayarlar, NTC ve NCS şartnameyi geçti Tabloda 6 TS'den önce Sonuç analizi. Eğer geçerse, o zaman devam et Bir sonraki adım. Değilse geçti, , TS sonuçlar mayıs Olumsuz olmak güvenilir, Ve

sebebinin araştırılması gerekiyor.

Eğer IC eklenirse: karşılık gelen sonuçları bulun FAM'ın sonuç bilgilerine göre yargı ve VİK Tablo 7'de:

Masa 7: Sonuç yargı ile ilgili TS (IC (eklendi)

*Eğer Orası dır inhibisyon için VİK sinyal,tedavi dır ihtiyaç duyulan ile elemek , inhibitörler veya tekrarlamak , test.

IC eklenmemişse: karşılık gelen sonuçları bulun yargıya göre Tablo 8'deki FAM'ın sonuç bilgisi ve analiz etmeye gerek yok VIC sinyali.

Masa 8: Sonuç yargı ile ilgili TS (IC Olumsuz (eklendi)

Notlar

1. Bu kiti kullanmadan önce lütfen bu kılavuzu dikkatlice okuyun. Deney, numune işleme, reaksiyon sisteminin hazırlanması ve numune ekleme dahil olmak üzere standart bir şekilde yürütülmelidir.

2. Mümkünse numune ekleme ve reaktif hazırlama işlemlerini buz üzerinde yapın.
3. Kullanmadan önce her reaktifi vorteksleyip iyice karıştırın.

4. Lütfen laboratuvar önlükleri ve tek kullanımlık eldivenlerle çalışın. Sizin güvenliğiniz.
5. Bu ürün yalnızca araştırma amaçlıdır.