Polibren (hekzadimetrin bromür), Polibren olarak da bilinir, memeli hücreleriyle yapılan DNA transfeksiyon deneylerinde lipozomların transfeksiyon verimliliğini artırmak için yaygın olarak kullanılan bir katyonik polimerdir. Retrovirüs aracılı gen transfeksiyonunda ve lentivirüs aracılı gen transfeksiyonunda yaygın olarak kullanılır. Etki mekanizması, hücre yüzeyindeki siyalik asidi nötralize ederek, virüs parçacıklarıyla elektrostatik itmeyi aşarak adsorpsiyonu kolaylaştırmayı içerebilir. Polibren ayrıca bir antikoagülan (heparin antagonisti) olarak da bilinir ve sıklıkla spesifik olmayan şekilde toplanmış kırmızı kan hücrelerinin üretiminde kullanılır. Ek olarak, protein dizilemesinde, düşük dozlarda Polibrenin otomatik dizileme analizinde peptitlerin bozunmasını önemli ölçüde iyileştirdiği gösterilmiştir. Polibrenin PVDF membranlara eklenmesi, membran afinitesini de artırabilir.

Şartname

Ürün çözelti formunda sağlanır ve toz, 10 mg/mL'lik bir çözelti yapmak için %0,9 NaCl'de yeniden oluşturulur ve ardından 0,22 μm'lik bir filtre kullanılarak sterilize edilir. Genellikle kullanım için 1:1000-1:2000 oranında seyreltilir ve ilgili literatürde belirtildiği gibi hücre tipine bağlı olarak belirli seyreltme oranları vardır.

Nakliye ve Depolama

Taşıma ve depolama -20 ºC'de önerilir ve raf ömrü 2 yıldır. Tekrarlanan dondurma-çözme döngülerinden kaçınmak için alikotlanması ve saklanması önerilir.

Önlemler:

1. Güvenlik ve sağlık için laboratuvar kıyafetleri ve tek kullanımlık eldivenler giyin.

2. Bu ürün yalnızca araştırma amaçlıdır.

Operasyonel adımlar

(Referans için, belirli konsantrasyonlar değişebilir, ilgili literatüre bakın):

Not: Polibren bazı hücrelere (terminal farklılaşmış nöronlar, DC hücreleri gibi) önemli toksisite gösterebilir ve ilk kullanım için bir toksisite testi önerilir.

Deney 1: Retroviral Enfeksiyon

1. Rekombinant retrovirüs stoğunun hazırlanması: Transfeksiyon retrovirüs paketleme hücrelerinin tek tabakasını içeren hücreleri 5 mL büyüme ortamı (serum %5) ile 100 mm'lik bir kapta kültürleyin. 24 saat sonra kültür ortamını çıkarın ve 0,45 μm'lik bir filtreden süzün.

2. Enfeksiyon için hücre kültürü: 100 mm'lik bir tabağa, hücre yoğunluğu 5x olan 10 mL tam büyüme ortamı ekleyin.10⁵ tabak başına.

3. Virüs enfeksiyonu: Hücre kültüründen 24 saat sonra, tüm kültür ortamını çıkarın. Hücreleri 37°C'de 3-6 saat boyunca Polibren içeren 2 mL virüs üst sıvısıyla (son konsantrasyon: 5-10 μg/mL) enfekte edin.

4. Virüs parçacıklarını toplayın: 8 mL tam büyüme ortamı ekleyin. 2-3 günlük kültürden sonra virüs parçacıkları elde etmek için kültür ortamını toplayın.

Deney 2: Transfeksiyon

1. Hücre yoğunluğu yaklaşık %50 olan tam büyüme ortamında kültür hücreleri.

2. 18-24 saatlik hücre kültüründen sonra, bir DNA-büyüme ortamı-Polybrene karışımı hazırlayın. Tam büyüme ortamını ekleyin (60 mm'lik bir kap için 2 mL, 100 mm'lik bir kap için 3 mL) ve 37°C'ye önceden ısıtın. 10 ng~10 µg plazmidi yavaşça karıştırın. Son konsantrasyonu 5-10 μg/mL olacak şekilde Polybrene ekleyin. Yavaşça karıştırın. Her bileşen belirtilen sırayla eklenmelidir.

3. Kültür ortamını çıkarın ve DNA-büyüme ortamı-Polybrene solüsyonunu hücrelere 37°C'de 6-20 saat boyunca ekleyin. Hücre kültürünün ilk 6 saati içinde her 1,5 saatte bir yavaşça karıştırın.

4. DNA büyüme ortamı-Polibren solüsyonunu çıkarın. Hücreleri DMSO şok solüsyonu (1× HBSS'de %15 DMSO) ile örtün.Çözeltiyi her eklediğinizde kültür kabını 10 saniye boyunca hafifçe çalkalayın ve eşit dağılımı sağlayın. Hücreleri 37°C'de 4 dakika inkübe edin.

5. DMSO şok solüsyonunu hemen çıkarın ve hücreleri iki kez tam büyüme ortamıyla nazikçe yıkayın. 60 mm'lik bir kap için her seferinde 5 mL kültür ortamıyla yıkayın ve 100 mm'lik bir kap için her seferinde 10 mL kültür ortamıyla yıkayın.

6. Hücrelere tam büyüme ortamı ekleyin.

7. Protein ekspresyonu: Kültürden 24-72 saat sonra, gerektiğinde protein ekspresyon analizi için hücreleri toplayın.

Hücre seçimi: Kültürden 24-72 saat sonra, hücre durumuna göre taze seçim ortamına geçilir ve hücre seçimine devam edilir.