Doğrusallaştırılmış Polietilenimin PEI 25000 Transfeksiyon Reaktifi, negatif yüklü nükleik asit moleküllerine kolayca bağlanan, bir kompleks oluşturan ve kompleksin hücreye girmesine izin veren yüksek yüklü bir katyonik polimerdir. Transfeksiyon reaktifi, düşük sitotoksisite, yüksek transfeksiyon verimliliği ve HEK293 ve CHO gibi hücrelerde yüksek gen ekspresyonu verimliliğine sahip geçici bir transfeksiyon reaktifidir. Doğrusal PEI transfeksiyon reaktifinin HEK-293, HEK293T, CHO-K1, COS-1, COS-7, NIH/3T3, Sf9, HepG2 ve Hela hücreleri vb. dahil olmak üzere çeşitli hücre hatlarına yaygın olarak uygulanabildiği doğrulanmıştır. Reaktif, serum içeren ortamlarla uyumludur ve nükleik asitleri hücrelere etkili bir şekilde sokabilir.

Şartname

Nakliye ve Depolama

Ürün oda sıcaklığında sevk edilir ve toz 2-8ºC'de iki yıl saklanabilir. Stok solüsyon 2-8 ºC'de 3 ay saklanır.

Dikkat Edilmesi Gerekenler


1) Hazırlanan PEI çözeltisi -20 ºC'den çıkarılıp çözüldükten sonra 4 ºC'lik buzdolabında saklanabilir ve tekrar dondurulmamalıdır.

2) Çoğu hücre için, 1 μg DNA başına 3,0 μL PEI transfeksiyon reaktifi yüksek transfeksiyon verimliliği sağlayabilir. Optimizasyon için 1 μg DNA başına 1,5~4 μL hacimde doğrusal PEI transfeksiyon reaktifi kullanmayı da deneyebilirsiniz.

3) Kendi güvenliğiniz ve sağlığınız için lütfen çalışırken laboratuvar önlüğü, tek kullanımlık eldiven ve davlumbaz giyin.

4) Bu ürün yalnızca bilimsel araştırma amaçlıdır, insan kullanımı için değildir.

Stok solüsyonu hazırlanması (1 mg/mL)


1. Malzemeler

PEI 25000, Milli-Q® su/enjeksiyonluk su (WFI) veya benzeri biyolojik sınıf su, 12 mol/L hidroklorik asit (HCl), 10 mol/L sodyum hidroksit (NaOH), tek kullanımlık 0,1~0,2 μm PES vakumlu steril filtre, steril HDPE veya polipropilen saklama şişesi.

2. Stok solüsyonu hazırlayın (1 mg/mL)

1) 1 L'lik cam behere, 1 g PEI 25000 tozunu 900 mL Milli-Q® ultra saf su veya eşdeğer biyolojik suya ekleyin ve küçük bir girdap oluşturmak için manyetik karıştırıcıda eşit şekilde karıştırın.

2) pH<2,0 olana kadar karıştırarak damla damla hidroklorik asit (12 mol/L) ekleyin.

3) Kabın ağzını kapatıp, tamamen eriyene kadar 3 saat boyunca karıştırın; işlem boyunca pH'ı 2,0'ın altında tutun.

【Not】: Çözülemeyen bazı küçük lifli parçacıklar olabilir, bu normal bir durumdur.

4) pH 6,9 ~7,1'e ulaşana kadar karıştırarak damla damla NaOH (10 mol/L) ekleyin.

5) Çözeltiyi dereceli silindire aktarın ve 1 L'ye kadar su ekleyin.

6) 0,1-0,2 µm PES vakumlu tek kullanımlık filtre ile filtreleyin ve sterilize edin ve 1 mg/mL stok solüsyonu elde edin.

7) Gerektiği kadar alınarak -20 °C'de saklanır, 1 yıl süreyle stabildir.

【Not】: Saklama solüsyonu tekrar çözüldükten sonra 4 °C'de saklanabilir ve 2 hafta boyunca stabildir, ancak tekrar dondurulmamalıdır.

Transfeksiyon prosedürü (örnek olarak 6-kuyulu plakayı ele alalım)


1. Hücre aşılaması: Transfeksiyon verimliliğini artırmak için, transfeksiyondan bir gün önce hücrelerin aşılanması önerilir ve transfeksiyon sırasında hücre yoğunluğunun tercihen %70~%80 olması önerilir.

2. DNA-PEI kompleksini hazırlayın: DNA-PEI nükleik asit-transfeksiyon reaktif kompleksini aşağıdaki sisteme göre hazırlayın:

1) Her hücre kuyusu için, 2 μg hedef DNA'yı 100 μL serumsuz ortamla seyreltin ve DNA seyreltmesi oluşturmak için iyice karıştırın.

[Not]: Serumsuz seyreltici için Opti-MEM veya ddH2O önerilir

2) Hemen 100 μL DNA dilüentine 5 μL PEI 25000 transfeksiyon reaktifi ekleyin, 10 saniye karıştırın ve iyice karıştırın.

3) DNA-PEI katyonik nükleik asit transfeksiyon reaktif kompleksini oluşturmak için oda sıcaklığında 10-25 dakika inkübe edin.

3. Transfekte hücreler:

1) Kompleks oluşumu sırasında hücre büyüme ortamını uzaklaştırın ve her kuyuya 2 mL taze önceden ısıtılmış tam ortam ekleyin.

2) 100 μL DNA-PEI nükleik asit-PEI kompleksini doğrudan hücrelere ekleyin, kültür plakasını çalkalayın ve yavaşça karıştırın.

3) 37°C, %5 CO2 inkübatöründe yetiştirin ve transgenin ekspresyonu transfeksiyondan 7 saat sonra tespit edilebilir. Lütfen uygun test süresini kendiniz belirleyin.

4. Sabit rotasyon taraması (isteğe bağlı)

Transfeksiyondan 24 saat sonra hücreler taze büyüme ortamına alt kültürlendi (hücreleri 10 kattan fazla seyreltin) ve %5 CO2 inkübatöründe 37 °C'de bir gece inkübe edildi. Ertesi gün, transfeksiyon direnç genine uyan bir tarama ilacı eklendi. İlaç dirençli klonlar yaklaşık 1 ila 2 hafta içinde taranabilir. Bu süre zarfında, tarama ilaçlarını içeren büyüme ortamının sık sık değiştirilmesi gerekir.

Farklı hücre kültürü kapları için transfeksiyon dozajları (sadece referans amaçlı):