Vero Konak Hücre DNA Kalıntısı Tespit Kiti, çeşitli biyolojik ürünlerin ara numunelerinde, yarı mamul ve mamul ürünlerinde Vero konak hücre DNA kalıntısının kantitatif analizi için kullanılır.

Bu kit, fg seviyesi minimum tespit limitine sahip olan ve kalan Vero hücre DNA'sını spesifik ve hızlı bir şekilde tespit edebilen Taqman floresan probunu ve polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) yöntemini kullanır. Kitin, Kalan DNA Örnek Hazırlama Kiti (Cat# 18461ES) ile birlikte kullanılması gerekir.

Ürün Bileşenler

^*IC：Dahili kontrol

Nakliye ve Depolama

1. Kuru buzla sevk edilir ve -20°C'de saklandı 2 için yıl

2. Ürünleri teslim aldıktan sonra lütfen kontrol edip, ilgili depolama sıcaklığında muhafaza ediniz.

Dikkat Edilmesi Gerekenler

1. Bu reaktifi kullanmadan önce lütfen bu kılavuzu dikkatlice okuyunuz ve numune kullanımı, reaksiyon sistemi hazırlama ve numune ekleme dahil olmak üzere deneyin standartlaştırılması gerekmektedir.

2. Numune ekleme ve çözelti hazırlama işlemleri en iyi şekilde buz üzerinde yapılır.

3. Kullanmadan önce her bir bileşenin tamamen girdaplandığından ve düşük hızda santrifüjlendiğinden emin olun.

4. Kendi güvenliğiniz ve sağlığınız için lütfen operasyon sırasında laboratuvar önlüğü ve tek kullanımlık eldiven giyin.

5. Bu ürün SADECE araştırma amaçlıdır!

Uygulanabilir enstrüman modelleri

Bunlarla sınırlı olmamak üzere şunları içerir:

Biyo-Rad: CFX96 Optik Modül.

Termo Bilimsel: ABİ 7500; ABI Quant Studio 5; ABI Adımı OnePlus.

Kullanım Talimatı

1. Vero DNA Standart seyreltme ve Standart eğri hazırlama

Vero DNA Kontrolü, kitte sağlanan DNA Seyreltme Tamponu kullanılarak gradyan seyreltildi. ve seyreltme konsantrasyonu 300 pg/μL, 30 pg/μL, 3 pg/μL, 300 fg/μL, 30 fg/μL, 3 fg/μL.

Ayrıntılı talimatları aşağıda bulabilirsiniz:

1.1 Çözün Vero Buz üzerinde DNA kontrol ve DNA seyreltme tamponu. Tamamen çözüldükten sonra hafifçe vorteksleyerek karıştırın ve düşük hızda 10 saniye santrifüjleyin.

1.2 Altı tane çıkar 3 ng/μL, ①, ②, ③, ④, ⑤, ⑥ ile işaretlenmiş temiz 1,5 mL tüpler.

1.3 90 μL DNA seyreltme tamponu ve 10 μL Vero ekleyin DNA Kontrolü 1'e.3 ng/μL etiketli 5 mL mikro santrifüj tüpü ve seyreltin 3 ng/μL. Karıştırın ve ardından 10 saniye santrifüj edin. Seyreltilmiş DNA standardını alt paketleyin ve kısa vadede (en fazla 3 ay) -80°C'de saklanabilir. Lütfen tekrarlanan dondurma-çözme işlemlerinden kaçının.

1.4 Diğerine 90 μL DNA seyreltme tamponu ekleyin tüplere koyun, ardından seri seyreltmeler için aşağıdaki prosedürü izleyin.

[Notlar]:

1. Her konsantrasyon için üç tekrar kuyusu gereklidir. Algılama aralığı 3'tür fg/μL-300pg/μL Ve İhtiyaç halinde bu aralık genişletilebilir.

2. Tekrarlanan dondurma-çözme sayısını azaltmak ve kontaminasyonu önlemek için DNA kontrolünün saklanması önerilir. -80°C'de ilk kez alikotlar halinde.

3. Çözüldükten sonra DNA seyreltme tamponu 2-8°C'de saklanmalıdır 7 gün, uzun süre kullanılmayacaksa -20°C'de saklayınız.

4. Şablonun tamamen karıştığından emin olun, karışımı 15 saniye ile 1 dakika arasında hafifçe çalkalayın. her bir gradyan seyreltme için.

2. Ekstraksiyon Kurtarma Kontrolü (ERC) hazırlığı

Konsantrasyonu ayarlayın Vero'nun ERC'deki DNA gerektiği gibi (ERC örneği) (örnek olarak 3 pg/μL DNA ile hazırlanmıştır) aşağıdaki gibidir:

2.1 Temiz bir 1,5 mL tüpe 100 μL test örneği ekleyin, ardından 10 μL 3pg/μL Vero ekleyin. DNA Standardı (③) ve ERC olarak işaretlenmiş şekilde iyice karıştırın.

2.2 ERC örneğinin DNA ekstraksiyonunu gerçekleştirin saflaştırılmış ERC'yi hazırlamak için test örnekleriyle birlikte örnek.

3. Pozitif Kontrol Örneği (PCS) hazırlanması (İsteğe bağlı)

Konsantrasyonu ayarlayın Vero'nun PCS'deki DNA gerektiği gibi (PCS) (örnek olarak 3 pg/μL DNA ile hazırlanmıştır) aşağıdaki gibidir:

3.1 100 μL 3 pg/μL Vero ekleyin DNA Standardı (③) Temiz bir 1,5 mL tüpe aktarılır ve PCS olarak işaretlenir.

3.2 PCS'nin DNA ekstraksiyonunu gerçekleştirin saflaştırılmış PCS'yi hazırlamak için test numuneleriyle birlikte.

4. Negatif Kontrol Çözeltisi (NCS) hazırlanması

Deneyde negatif kontrolün ayarlanması için özel işlem adımları şu şekildedir:

4.1 100 μL ekleyin Örnek matrisini (veya DNA seyreltme tamponunu) temiz bir 1,5 mL tüpe koyun ve ardından NCS olarak işaretleyin.

4.2 Saflaştırılmış NCS örneğini hazırlamak için test örnekleriyle birlikte NCS örneğinin DNA ekstraksiyonunu gerçekleştirin.

5. Şablon Kontrolü Yok (NTC) hazırlığı

Şablonu ayarla Deneyde kontrol için özel işlem adımları şu şekildedir:

5.1 NTC, numune ön işlemi gerektirmez ve kalıntı DNA içeriğinin qPCR tespiti aşamasında yapılandırılabilir.

5.2 Her tüp veya kuyudaki NTC örneği 20 μL Karıştırın (yani 16) μL Vero qPCR karışımı + 4 μL Vero Primer ve prob karışımı) + ​​20 μL DNA Seyreltme Tamponu. Üç tekrar kuyusunun yapılandırılması önerilir.

6. PCR reaksiyon sistemi

[Notlar]:

1. Toplam PCR reaksiyon hacmini reaksiyon sayısına göre hesaplayın: qPCR Karışımı = (reaksiyon sayısı + 2) × (16 + 4) μL (iki reaksiyon kuyusunun kayıpları dahil). Deneyde her numune için üçten fazla tekrar yapılması önerilir.

2. Tüpü kapattıktan veya plakayı mühürledikten sonra, reaksiyon tüpünü veya plakayı düşük hızda 10 saniye santrifüj edin. 5 saniye boyunca yeterli çalkalama ve karıştırmadan sonra, sıvıyı kapaktan veya duvardan dibe toplamak için santrifüjü tekrarlayın. Çalışma sırasında kabarcıklardan kaçının.

Önerilen Plaka kurulumu için aşağıdaki tabloya bakın:

Plaka düzeni şunları içerir: 1 NTC (hayır) şablon kontrol), 1 NCS (negatif kontrol çözüm), 6 STD (6'nın standart eğrisi) standart konsantrasyonlar), 3 TS (test örnekleri), 3 ERC (ekstraksiyon geri kazanım kontrolü), 1 ADET (pozitif kontrol örneği).Her numune için üç tekrar kuyusu.

7. PCR Cihazı için Kurulum Yönergeleri (2 adımlı yöntem)

Aşağıdaki talimatlar yalnızca Thermo ABI 7500 qPCR cihazı için geçerlidir (Yazılım sürümü 2.0). Farklı bir enstrüman kullanıyorsanız, kurulum yönergeleri için geçerli enstrüman kılavuzuna bakın.

7.1 Yeni bir deney oluşturun, mutlak kantifikasyon veya kullanıcı tanımlı şablonu seçin.

7.2 'Tanımla' arayüzünde ve 'Hedefler' bölmesinde bir hedef ekleyin ve FAM olarak adlandırın, muhabiri 'FAM' ve söndürücüyü 'hiçbiri' olarak seçin.

7.3 'Örnekler' bölmesinde, tüm örnek bilgilerini sırayla ekleyin. Ardından kuyuları seçin, hedefi ve örnekleri buna göre seçin. Vero görevini ayarlayın DNA standardı standarttır ve 300000, 30000, 3000, 300, 30, 3 değerlerini atayın (Her kuyudaki DNA konsantrasyonunun birimi fg/μL'dir) Miktar sütununa yazın ve kuyulara STD 1, STD 2, STD 3, STD 4, STD 5 adını verin. STD 6, buna göre. NTC'nin görevini NTC olarak ayarlayın. NCS, TS, ERC'yi ayarlayın ve PCS Bilinmeyen olarak adlandırın ve yukarıdaki Plaka düzenine göre adlandırın. Sonra İleri'ye tıklayın.

7.4 Amplifikasyon programını ayarlayın: Reaksiyon hacmini 40 μL olarak ayarlayın.

8. qPCR sonuçlarının analizi

8.1 Sistem Analiz'in Amplifikasyon Grafiği panelinde Eşik değerini otomatik olarak verecektir. Sistem tarafından verilen Eşik değeri bazen taban çizgisine çok yakındır ve bu da tekrar kuyuları arasında Ct'de büyük bir farka neden olur. Eşik değerini manuel olarak uygun bir konuma ayarlayabilir ve Analiz'e tıklayabilirsiniz. Daha sonra başlangıçta Çok Bileşenli Grafiğin amplifikasyon eğrisinin normal olup olmadığını kontrol edebilirsiniz.

8.2 Sonuç Analizi sekmesinde, Standart Eğri grafiğini inceleyin. Eğim, Y-kesişimi, R2 değerlerini doğrulayın ve Verimlilik. Normal bir standart eğri için, R²>0,99; 90%≤Eff%≤110%.

8.3 İçinde 'Kuyu tablosunu görüntüle' Analiz bölmesinde, her numunenin konsantrasyonları Miktar bölümünde gösterilir, birim fg/μL'dir, birimler pg/μL'ye dönüştürülebilir veya analiz raporunda pg/mL.

Kılavuzlar