Replikasyon yeteneğine sahip Lentivirüs (RCL) Tespit Kiti kullanılır çoğalan lentivirüsleri niceliksel olarak tespit etmek için bir şekilde meydana gelebilir lentiviral ile ilişkili çeşitli hücre ürünleri vektörlerin potansiyel riskleri.

Bu kit, aşağıdakiler için özel astarlar tasarlar: Lentiviral zarf proteinlerinin VSV-G gen dizisi. Ve takman'ı benimser  floresan prob ve 1 kopya/μL düzeyinde tespit sınırı olan polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) yöntemi ve belirli ve hızlı bir şekilde tespit edebilir replikasyon yeteneğine sahip lentivirüs riski. Kitin ihtiyacı birlikte kullanılmak üzere Kalan DNA Örnek Hazırlama Kiti (Kat# 18461ES).

Bileşenler

* İC： Dahili kontrol.

Depolamak

Bu ürün -25~-15℃'de saklanmalıdır 2 için Yıllar.

Hem 41311-A hem de 41311-B ışıktan korunarak saklanmalıdır.

Uygulanabilir enstrüman modeller

Bunlarla sınırlı olmamak üzere şunları içerir: Bio-Rad: CFX96 Optik Modülü; Thermo Scientific: ABİ 7500; ABI Quant Studio 5; ABI Adımı OnePlus.

Talimatlar

1. RCL DNA Standart seyreltme Ve Standart eğri hazırlık

RCL DNA Kontrolü, kitte sağlanan DNA Seyreltme Tamponu kullanılarak gradyan seyreltildi* ve seyreltme konsantrasyon 5×10E7 kopya/μL, 5×10E6 kopya/μL, 5×10E5 kopya/μL, 5×10E4 kopya/μL, 5×10E3 kopya/μL, 5×10E2 kopya/μL, 5×10E1 kopya/μL.

Ayrıntılı talimatları aşağıda bulabilirsiniz:

1) RCL DNA kontrolünü ve DNA seyreltme tamponunu buz üzerinde çözdürün. Tamamen çözüldükten sonra, yavaşça girdap yapmak karıştırmak ve Düşük hızda 10 saniye santrifüjleyin.

2) Std0, Std1, Std2, Std3, Std4, Std5, Std6 işaretli yedi adet temiz 1,5 mL tüp çıkarın.

3) 90 ekle μL DNA seyreltme tamponu ve 10 Std0 etiketli 1,5 mL mikrofüj tüpüne μL RCL DNA Kontrolü, yani   5×10E7'ye seyreltin kopya/μL. Karıştır ve sonra 10 saniye santrifüjleyin. Seyreltilmiş DNA standardını alt paketleyin ve kısa vadede (en fazla 3 ay) -25~-15℃**'de saklanır .Lütfen tekrarlanan dondurma-çözme işlemlerinden kaçının.

4) 90 ekle µL DNA seyreltme tamponu diğer tüplere*** , ardından aşağıdaki prosedürü izleyin seri seyreltmeler**** .

Tablo1 Standart gradyan seyreltmesi

*Üç çoğaltmak kuyular vardır gerekli için her biri Konsantrasyon. tespit menzil dır 5×10E1 kopyalar/μL~5×10E6 kopya/μL Ve Bu menzil olabilmek olmak Gerektiğinde genişletilir.

** İle azaltmak , sayı ile ilgili tekrarlamak donma-çözülme Ve kaçınmak kirlenme, bu dır tavsiye edilen ile mağaza , DNA kontrol içinde alikotlar de -25~-15℃ için , Birinci zaman.

*** Bir kere çözülmüş, DNA seyreltme tampon olabilir olmak saklandı de 2-8°C için 7 gün, eğer Olumsuz kullanılmış için A uzun zaman lütfen mağaza de -25~-15℃ .

**** Yapmak Elbette , şablon dır tamamen karışık, yavaşça sallamak , karışım için 15 saniye ile 1 dk için her biri eğim seyreltme.

2. Çıkarma Kurtarma Kontrol (Acil Durum Bildirimi) hazırlık

ERC'deki RCL DNA konsantrasyonunu gerektiği gibi ayarlayın (ERC örneği 5×10E4 ile hazırlandı) RCL DNA'sını şu şekilde kopyalar: (bir örnek) aşağıdaki gibidir:

1) 100 ekle μL test örneğini temiz bir 1,5 mL tüpe koyun, ardından 10 μL 5×10E3 kopya/μL RCL DNA Standardı (Std4) ve İyice karıştırın, ERC olarak işaretlenmiştir.

2) Saflaştırılmış ERC örneğini hazırlamak için test örnekleriyle birlikte ERC örneğinin DNA ekstraksiyonunu gerçekleştirin.

3. Negatif Kontrol Çözüm (NCS) hazırlık

Deneyde negatif kontrolün ayarlanması için özel işlem adımları şu şekildedir:

1) 100 ekle μL örnek matrisini (veya DNA seyreltme tamponunu) temiz bir 1,5 mL tüpe koyun, ardından işaretleyin NÇS.

2) NCS'nin DNA ekstraksiyonunu gerçekleştirin saflaştırılmış NCS'yi hazırlamak için test örnekleriyle birlikte numune örnek.

4. Şablon Yok Kontrol (NTC) hazırlık

Deneyde şablonsuz kontrolü ayarlayın, özel işlem adımları aşağıdaki gibidir:

1) NTC, numune ön işlemi gerektirmez ve kalıntı DNA'nın qPCR tespiti aşamasında yapılandırılabilir içerik.

2) Her tüp veya kuyudaki NTC örneği 20'dir μL Karışımı (yani 15 μL RCL qPCR Karışımı + 4 μL RCL Primer ve prob Karıştır + 1 μL IC) + 10 μL DNA Seyreltme Tamponu. Üç tekrar kuyusunun yapılandırılması önerilir.

5. PCR tepki sistem

Tablo2 Reaksiyon sistemi

* Hesaplamak , toplam PCR tepki hacim ile , sayı ile ilgili tepkimeler: qPCR Karışım =(bu sayı ile ilgili tepkiler+2) × (15+4+1) μL (dahil olmak üzere) , kayıpları (iki reaksiyon kuyusu). Deneyde her numune için üçten fazla tekrar yapılması önerilir.

** Sonrasında kapaklama , tüp veya mühürleme , plaka, santrifüj , tepki tüp veya plaka de Düşük hız için 10 saniye sonra yeterli sallama Ve karıştırma için 5 saniye, tekrarla santrifüj ile TOPLAMAK , sıvı itibaren , kapak veya duvar ile , alt. Kaçının kabarcıklar sırasında operasyon.

Önerilen Plaka kurulumu için aşağıdaki tabloya bakın:

Tablo3 Bilgisayar açık referans pano

Plaka düzeni şunları içerir: 6 Std (6 standart konsantrasyonun standart eğrisi), 1 NTC (şablon kontrolü yok), 1 NCS (negatif kontrol solüsyonu), 3 TS (test numuneleri), 3 ERC (ekstraksiyon geri kazanım kontrolü).Üç tekrar kuyusu her numune.

6. Kurulum yönergeleri için A PCR Enstrüman

Aşağıdaki talimatlar yalnızca şunlar için geçerlidir: Termo ABI 7500 qPCR cihazı (Yazılım sürüm 2.0). Eğer sen bir tane kullanıyorsun farklı bir enstrüman kullanıyorsanız, kurulum yönergeleri için geçerli enstrüman kılavuzuna bakın.

1) Yeni bir deney oluşturun, mutlak kantifikasyon şablonunu seçin veya kullanıcı tanımlı.

2) "RCL-DNA" adlı 1 tespit probu oluşturun, muhabir floroforu "FAM" olarak seçin ve floroforu şu şekilde söndürün: "hiçbiri"; 1 tane daha tespit probu oluşturun, "IC" adını verin ve muhabir floroforunu "CY" olarak seçin5" ve söndürme florofor "hiçbiri" olarak. Referans floresansı ROX'tur" (referans floresansı aşağıdakilere dayalı olabilir: enstrüman modeli vb. seçin ikisinden biri (eklemeniz gerekiyor).

3) İçinde 'Örnekler' bölmesinde, tüm örnek bilgilerini sırayla ekleyin. Ardından kuyuları seçin, hedefi seçin ve örnekler buna göre ayarlanmıştır. RCL DNA standardının standart olarak görevini yerine getirmesi ve ataması değerler 5000000, 500000, Miktar sütununa 50000, 5000, 500, 50 (her kuyudaki DNA konsantrasyonunun birimi kopya/μL'dir) yazın ve adlandırın  kuyular Std 1, Std 2, Std 3, Std 4, Std 5, Std 6, sırasıyla. NTC'nin görevi NTC olarak belirlenir. NCS, TS ve ERC'yi Bilinmiyor ve yukarıdaki Plaka düzenine göre isimlendirildi. Daha sonra ileri butonuna tıklayın.

4) Amplifikasyon programını ayarlayın: reaksiyon hacmini 30 μL olarak ayarlayın.

Tablo4 Amplifikasyon prosedürü

7. Analizi qPCR sonuçlar

1) Sistem Eşik değerini otomatik olarak verecektir Amplifikasyon Plot paneli Analiz. Verilen Eşik sistem bazen temel değere çok yakın olduğundan, büyük bir fark ortaya çıkıyor Tekrarlanan kuyular arasındaki Ct'de. Manuel olarak ayarlayabilirsiniz Eşiği uygun bir konuma getirin ve tıklayın Analiz edin. Daha sonra ilk olarak kontrol edebilirsiniz Çok Bileşenli Grafikte amplifikasyon eğrisinin normal olup olmadığı.

2) Sonuç Olarak Analiz sekmesinden Standart Eğri grafiğini inceleyin. Doğrulayın R2, Verimlilik, Eğim ve değerleri Y-kesişimi. Normal bir standart eğri için, R²>0,99, 90%≤Eff%≤110%, -3,6≤Slope≤-3,1.

3) İçinde 'Görüş iyi masa' camı Analiz, her numunenin konsantrasyonları Miktar bölümünde gösterilir. birim kopya/μL'dir, birimler deney raporunda dönüştürülebilir.

4) Parametre ayarları Sonuç analizinin belirli modele ve yazılıma dayalı olması gerekir versiyon kullanılır ve genellikle enstrüman tarafından otomatik olarak yorumlanabilir.

5) Test sonuçlarına göre spike kurtarma oranını hesaplayın. örnek TS ölçülecek ve örnek sivriltilecek kurtarma ERC, kurtarma oranı sivri uçlar gereklidir %50~%150 arasında olmalıdır.Çarpık kurtarma oranı ölçer formülü:

Kurtarma (%) = {Sample spiked assay (eg.copies/μL) - Sample assay (eg.copies/μL)} x Elüsyon hacmi (μL) / Teorik DNA ekleme miktarının değeri (örn.kopyalar) x %100。

6) Mahkeme değeri negatif kontrol NCS ortalamadan büyük olmalı en düşük konsantrasyon Ct , standart.

7) Şablon ücretsiz kontrol NTC Belirsiz veya Ct olmalıdır değer ≥38.

Notlar

1. Bu ürün yalnızca araştırma amaçlıdır.
2. Lütfen güvenliğiniz için laboratuvar önlüğü ve tek kullanımlık eldivenlerle çalışın.

3.Lütfen kullanmadan önce bu kılavuzu dikkatlice okuyun. bu reaktif ve deney, dahil olmak üzere standartlaştırılmalıdır numune işleme, reaksiyon sistemi hazırlama ve örnek ekleme.

4.Kullanmadan önce her bileşenin tamamen girdaplandığından ve düşük hızda santrifüjlendiğinden emin olun.

Manuel