HEK293 Konak Hücre DNA Kalıntısı Tespit Kiti, HEK293'ün kantitatif analizi için kullanılır Çeşitli biyolojik ürünlerin ara numunelerinde, yarı mamul ve mamul ürünlerinde konak hücre DNA kalıntıları.

Bu kit, fg seviyesi minimum tespit sınırına sahip olan ve kalan HEK293'ü özel ve hızlı bir şekilde tespit edebilen Taqman floresan probunu ve polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) yöntemini benimser. hücre DNA'sı.UDG enzimi ve dUTP'nin birlikte kullanımı, amplifikasyon ürünlerinin neden olduğu kontaminasyonu ortadan kaldırabilir. Kitin, Kalan DNA Örnek Hazırlama Kiti (Cat# 18461ES) ile birlikte kullanılması gerekir.

Doğrulama Raporu

Özellikler

Bileşenler

Depolamak

Bu ürün -25~-15℃'de 2 yıl saklanmalıdır.

Hem 41331-A hem de 41331-B ışıktan korunarak saklanmalıdır.

Uygulanabilir enstrüman modelleri

Bunlarla sınırlı olmamak üzere şunları içerir:

Bio-Rad: CFX96 Optik Modül.

Termo Bilimsel: ABI 7500; ABI Quant Studio 5.

Talimatlar

1. HEK293DNA Standart seyreltme ve Standart eğri hazırlama

HEK293 DNA Kontrolü, kitte sağlanan DNA Seyreltme Tamponu kullanılarak gradyan seyreltildi^*ve seyreltme

Konsantrasyon 300 pg/μL, 30 pg/μL, 3 pg/μL, 300 fg/μL, 30 fg/μL'dir.

Ayrıntılı talimatları aşağıda bulabilirsiniz:

• HEK293DNA kontrolünü ve DNA seyreltme tamponunu buz üzerinde çözün. Tamamen çözüldükten sonra, karıştırmak için hafifçe vorteksleyin ve düşük hızda 10 saniye santrifüj edin.
• Std0, Std1, Std2, Std3, Std4, Std5 işaretli 6 adet 1,5 mL'lik tüpü çıkarın.
• Std0 etiketli 1,5 mL mikrofüj tüpüne 90 μL DNA seyreltme tamponu ve 10 μL HEK293DNA Kontrolü ekleyin, yani 3 ng/μL'ye seyreltin. Karıştırın ve ardından 10 saniye santrifüj edin. Seyreltilmiş DNA standardını alt paketleyin ve kısa vadede (en fazla 3 ay) -25~-15℃'de saklanabilir^**.Lütfen tekrarlanan dondurma-çözme işlemlerinden kaçının.
• Diğer tüplere 90 μL DNA seyreltme tamponu ekleyin^***, ardından seri seyreltmeler için aşağıdaki prosedürü izleyin^****.

Tablo1 Standart gradyan seyreltmesi

^*Her konsantrasyon için üç tekrar kuyusu gereklidir. Tespit aralığı 30'dur. fg/μL~300pg/μL arasındadır ve bu aralık genişletilebilir.

^**Tekrarlanan dondurma-çözme sayısını azaltmak ve kontaminasyonu önlemek için, DNA kontrolünün ilk kez -25~-15℃'de alikotlar halinde saklanması önerilir.

^***DNA seyreltme tamponu çözüldükten sonra 2-8°C'de 7 gün boyunca saklanabilir, uzun süre kullanılmayacaksa lütfen -25~-15℃'de saklayın.

^****Şablonun tamamen karıştığından emin olun, her gradyan seyreltmesinde karışımı 15 saniye ile 1 dakika arasında yavaşça çalkalayın.

2. Ekstraksiyon Kurtarma Kontrolü (ERC) hazırlığı

ERC'deki HEK293 DNA konsantrasyonunu gerektiği gibi ayarlayın (örnek olarak ERC örneği 30 pg HEK293 DNA'sı ile hazırlanmıştır), aşağıdaki şekilde:

• Temiz 1,5 mL tüpe 100 μL test örneği ekleyin, ardından 10 μL 3pg/μL HEK293 DNA Standardı (Std3) ekleyin ve ERC olarak işaretlenmiş şekilde iyice karıştırın.
• Saflaştırılmış ERC örneğini hazırlamak için test örnekleriyle birlikte ERC örneğinin DNA ekstraksiyonunu gerçekleştirin.

3. Negatif Kontrol Çözeltisi (NCS) hazırlanması

Deneyde negatif kontrolün ayarlanması için özel işlem adımları şu şekildedir:

1) Temiz 1,5 mL tüpe 100 μL numune matrisi (veya DNA seyreltme tamponu) ekleyin ve ardından NCS olarak işaretleyin.

2) Saflaştırılmış NCS örneğini hazırlamak için test örnekleriyle birlikte NCS örneğinin DNA ekstraksiyonunu gerçekleştirin.

4. Şablon Kontrolü Yok (NTC) hazırlığı

Deneyde şablonsuz kontrolü ayarlayın, özel işlem adımları aşağıdaki gibidir:

1) NTC, numune ön işlemi gerektirmez ve kalan DNA'nın qPCR tespiti aşamasında yapılandırılabilir.

2) Her tüp veya kuyudaki NTC örneği 20 μL Karışımdır (yani 15 μL HEK293 qPCR Karışımı + 5 μL HEK293 Primer ve Prob Karışımı) + ​​10 μL DNA Seyreltme Tamponu. Üç tekrar kuyusunun yapılandırılması önerilir.

5. PCR reaksiyon sistemi

Tablo2 Reaksiyon sistemi

^*Toplam PCR reaksiyon hacmini reaksiyon sayısına göre hesaplayın: qPCR Karışımı = (reaksiyon sayısı + 2) × (15 + 5) μL (iki reaksiyon kuyusunun kayıpları dahil). Deneyde her numune için üçten fazla tekrar yapılması önerilir.

^**Tüpü kapattıktan veya plakayı mühürledikten sonra, reaksiyon tüpünü veya plakayı düşük hızda 10 saniye santrifüj edin. 5 saniye boyunca yeterli çalkalama ve karıştırmadan sonra, sıvıyı kapaktan veya duvardan dibe toplamak için santrifüjü tekrarlayın. Çalışma sırasında kabarcıklardan kaçının.

Önerilen Plaka kurulumu için aşağıdaki tabloya bakın:

Tablo3 Bilgisayarda referans kartı

Plaka düzeni şunları içerir: 5 Std (5 standart konsantrasyonun standart eğrisi), 1 NTC (şablonsuz kontrol), 1 NCS (negatif kontrol çözeltisi), 3 TS (test örnekleri), 3 ERC (ekstraksiyon geri kazanım kontrolü).Her numune için üç tekrar kuyusu.

6. Kurmak PCR Enstrümanı için kılavuzlar(2 adımlı yöntem) （örn. Thermo ABI 7500 qPCR cihazı, Sürüm 2.0 yazılımı）

Aşağıdaki talimatlar yalnızca Thermo ABI 7500 qPCR cihazı (Yazılım sürümü 2.0) için geçerlidir. Farklı bir cihaz kullanıyorsanız, kurulum yönergeleri için geçerli cihaz kılavuzuna bakın.

1) Yeni bir deney oluşturun, mutlak kantifikasyon veya kullanıcı tanımlı şablonu seçin.

2) "HEK293-DNA" adlı 1 tespit probu oluşturun, muhabir floroforu "FAM" olarak seçin ve floroforu "Hiçbiri" olarak söndürün. Referans floresansı ROX'tur (referans floresansı cihaz modeline vb. dayalı olabilir, eklemeniz gerekip gerekmediğini seçin).

3) 'Örnekler' bölmesinde, tüm örnek bilgilerini sırayla ekleyin. Ardından kuyuları seçin, hedefi ve örnekleri buna göre seçin. HEK293 görevini ayarlayın DNA standardını standart olarak belirleyin ve Miktar sütununa 300000, 30000, 3000, 3000, 300, 30 değerlerini (her kuyudaki DNA konsantrasyonunun birimi fg/μL'dir) atayın ve kuyulara Std adını verin 1, Sınıf 2, Sınıf 3, Sınıf 4, Sınıf 5, buna göre. NTC görevini NTC olarak ayarlayın. NCS, TS ve ERC'yi ayarlayın Bilinmeyen olarak adlandırın ve yukarıdaki Plaka düzenine göre adlandırın. Sonra İleri'ye tıklayın.

4) Amplifikasyon programını ayarlayın: reaksiyon hacmini 30 μL olarak ayarlayın.

Tablo4 Amplifikasyon prosedürü

7. qPCR sonuçlarının analizi

1) Sistem, Analiz'in Amplifikasyon Grafiği panelinde Eşik değerini otomatik olarak verecektir. Sistem tarafından verilen Eşik değeri bazen taban çizgisine çok yakındır ve bu da tekrar kuyuları arasında Ct'de büyük bir farka neden olur. Eşik değerini manuel olarak uygun bir konuma ayarlayabilir ve Analiz'e tıklayabilirsiniz. Daha sonra, başlangıçta Çok Bileşenli Grafik'te amplifikasyon eğrisinin normal olup olmadığını kontrol edebilirsiniz.

2) Sonuç Analizi sekmesinde, Standart Eğri grafiğini inceleyin. R için değerleri doğrulayın², Verimlilik, Eğim ve Y-kesişimi. Normal bir standart eğri için, R²>0,99, 90%≤Eff%≤110%, -3,6≤Eğim≤-3,1.

3) Analiz bölümündeki 'Kuyu tablosunu görüntüle' bölmesinde, her numunenin konsantrasyonları Miktar kısmında gösterilir, birimi fg/μL'dir, birimler deney raporunda dönüştürülebilir.

4) Sonuç analizinin parametre ayarları, kullanılan özel modele ve yazılım versiyonuna dayalı olmalı ve genellikle cihaz tarafından otomatik olarak yorumlanabilmelidir.

5) Ölçülecek numune TS'nin test sonuçlarına ve numune spike kurtarma ERC'sine dayanarak spike kurtarma oranını hesaplayın, spike kurtarma oranının %50~%150 arasında olması gerekir. Spike kurtarma oranı ölçer formülü: Kurtarma (%) = {Sample spiked assay (eg.pg/μL) - Sample assay (eg.pg/μL)} x Elüsyon hacmi (μL) / DNA ekleme miktarının teorik değeri (örn. pg) x %100。

6) Negatif kontrol NCS’nin Ct değeri, standardın en düşük konsantrasyonunun Ct ortalamasından büyük olmalıdır.

• Şablonsuz kontrol NTC Belirsiz veya Ct değeri ≥3 olmalıdır

Notlar

1. Bu ürün yalnızca araştırma amaçlıdır.
2. Lütfen güvenliğiniz için laboratuvar önlüğü ve tek kullanımlık eldivenlerle çalışın.

3.Bu reaktifi kullanmadan önce lütfen bu kılavuzu dikkatlice okuyunuz ve numune kullanımı, reaksiyon sistemi hazırlama ve numune ekleme dahil olmak üzere deneyin standartlaştırılması gerekmektedir.

4.Kullanmadan önce her bileşenin tamamen girdaplandığından ve düşük hızda santrifüjlendiğinden emin olun.

Kılavuzlar