Reaktif Oksijen Türleri Testi Kiti, canlı hücre örneklerindeki reaktif oksijen türlerini kantitatif olarak değerlendirmek için hücre geçirgen reaktif 2',7'–diklorofloresin diasetat (DCFDA) kullanır. Lipofilik floresan olmayan DCFDA, pasif difüzyon ve ardından deasetilasyon yoluyla hücre zarını kolayca geçer. Deasile edilmiş ürün, oksidan duyarlı bir 2',7'-diklorofloresindir (DCHF). DCHF daha sonra ROS tarafından oksitlenerek DCF oluşturur. DCF oldukça floresandır ve 480 nm/525 nm'de uyarma/emisyonla floresan spektroskopisi veya Akış sitometrisi ile tespit edilir. Bir bileşik karışımı olan Rosup, bir ROS indükleyicisidir ve pozitif kontrol olarak kullanılabilir.

Ürün Bileşenleri

Nakliye ve Depolama

Bu kit bir buz torbasıyla birlikte gönderilir. 1 yıl boyunca ışık olmadan -20°C'de saklayın. Tekrar tekrar dondurma ve çözmeden kaçının.

Uygulama yöntemi

1. Reaktif Hazırlama
DCFH-DA Çözeltisi: Açmadan önce düşük hızda kısa bir süre santrifüj edin. 10 μM'lik son konsantrasyona ulaşmak için serum içermeyen ortamda 10 mM DCFH-DA'yı seyrelterek bir çalışma DCFH-DA çözeltisi hazırlayın.
[Not]: DCFH-DA, fenol kırmızısı olmayan ortamlarda da seyreltilebilir. Taze hazırlanmış DCFH-DA solüsyonu kullanın, seyreltilmiş DCFH-DA'nın uzun süreli saklanması önerilmez. Gerekli DCFH-DA'nın kesin konsantrasyonu, kullanılan hücre hattına bağlı olacaktır ancak genel bir başlangıç ​​aralığı 10-50 μM olacaktır. Bazı hücreler için, negatif kontrolün (DCFH-DA probu olmadan) floresansı çok güçlüyse, DCFH-DA'yı 2-5 μM'ye seyreltin ve inkübasyon süresini kısaltın uygun şekilde.
Rosup Çözeltisi: 100 mM Rosup stok çözeltisini serumsuz ortamda seyrelterek 100 µM Rosup çalışma çözeltisi hazırlayın. Genellikle, karanlıkta 37 ℃'de 30 dk-4 saat Rosup ile inkübasyon ROS'u önemli ölçüde artırabilir.
[Not]: Rosup'un inkübasyon süresi hücre hattının duyarlılığına bağlı olacaktır. Örneğin, Hela için 30 dakika ve MRC5 için 1,5 saat. ROS artışı 30 dakika içinde gözlenmezse, indüksiyon süresi veya konsantrasyon uygun şekilde artırılabilir. ROS çok hızlı yükselirse, indüksiyon süresi veya konsantrasyon uygun şekilde azaltılabilir.
İlaçlar: İlgilendiğiniz ilacı, %10 FBS veya diğer uygun solüsyon içeren tam besiyerinde istenilen konsantrasyona kadar hazırlayın.
2. Yapışkan Hücreler için Önerilen Protokol
a) Hücre hazırlama: Deneyden bir gün önce, deney sırasında hücre birleşmesi %70'e ulaşacak şekilde, yapışan hücreleri standart hücre kültürü ortamında büyütün.
b) İlaç indüksiyonu: Ortamı çıkarın. Her bir kuyucuğu önceden hazırlanmış serumsuz seyreltilmiş ilaçlarla kaplayın ve karanlıkta 37°C'de istenilen süre boyunca inkübe edin.
c) (İsteğe bağlı) Pozitif kontrol: Pozitif kontrol kuyucuğuna önceden hazırlanmış Rosup solüsyonu koyun ve karanlıkta 37°C'de istenilen süre inkübe edin.
[Not]: Kısa uyarım süresine sahip hücreler için (genellikle 2 saat içinde), prob önce yüklenebilir ve ardından Rosup veya ilgi duyulan bir ilaç eklenebilir.
d) ROS prob yükleme: Tüm ortamı çıkarın ve hücreleri serumsuz ortamla 1-2 kez yıkayın. Her bir kuyucuğu önceden hazırlanmış DCFH-DA Çözeltisi ile kaplayın. Karanlıkta 37℃'de 30 dakika inkübe edin.
e) Ortamı uzaklaştırın ve serbest DCFH-DA'yı uzaklaştırmak için hücreleri serumsuz ortamla 1-2 kez yıkayın.
3. Süspansiyon Hücreleri için Önerilen Protokol
a) Hücre hazırlama: Deney gününde kuyu başına yaklaşık 1,5 × 105 hücre olacak şekilde süspansiyon hücrelerini büyütün.
b) İlaç indüksiyonu: Hücreler santrifüj edilerek konik bir tüpe alınır ve daha önceden hazırlanmış serumsuz seyreltilmiş ilaçların uygun miktarında tekrar süspanse edilir ve karanlıkta 37°C'de istenilen süre inkübe edilir.
c) (İsteğe bağlı) Pozitif kontrol: Pozitif kontrol hücreleri daha önceden hazırlanmış Rosup solüsyonu ile resüspanse edilerek karanlıkta 37°C’de istenilen süre inkübe edilir.
d) ROS prob yükleme: Yeni bir tüpe toplayın ve hücreleri PBS'de iki kez santrifüj ederek yıkayın. Hücreleri daha önce hazırlanmış DCFH-DA Solüsyonu ile 1×106-2×107/mL hücre yoğunluğunda yeniden süspanse edin. Ardından karanlıkta 37℃'de 30 dakika inkübe edin. Prob ile hücreler arasında tam temas sağlamak için tüpü her 3-5 dakikada bir ters çevirin.
[Not]: Hücre yoğunluğu, sonraki tespit yöntemine göre ayarlanmalıdır. Örneğin, akış sitometrisi için, tek bir tüpteki hücre sayısı 104/mL'den az veya 106/mL'den fazla olmamalıdır.
e) Hücreleri toplayın ve serbest DCFH-DA'yı uzaklaştırmak için serumsuz besiyerinde iki kez santrifüj ederek yıkayın.
4. Floresan tespiti ve Veri Analizi
Floresan mikroskopisi Ölçüm: Floresan mikroskopisi kullanarak floresan için uygun bir filtre seti (FITC) ile canlı hücre mikroskopisi gerçekleştirin. Hücreleri parlaklık açısından görsel olarak puanlayın ve kontrol ve örnekler arasında karşılaştırma yapın veya hücrelerin dijital fotoğrafları arasındaki sinyalleri karşılaştırmak için görüntü analiz yöntemlerini kullanın.
Akış Sitometrisi Ölçümü: Yapışkan hücreler tek bir hücre süspansiyonu hazırlamak için tripsinle toplanmalıdır; Süspansiyon hücreleri için hücreler doğrudan toplanır. İdeal olarak, deneysel koşul başına 10.000 hücre analiz edilmelidir. Hücreler deney sırasında aşırı yoğun olmamalıdır (<1 ×106 hücre/mL). Enkazı hariç tutun ve gating ile ilgi hücre popülasyonunu izole edin. Ortalama floresan yoğunluğunu kullanarak, Ex/Em = 480/525 nm ile kontrol ve işlenmiş numuneler arasındaki kat değişimini belirleyin.
Floresan Mikroplaka Ölçümü: Plakayı hemen bir floresan plaka okuyucusunda Ex/Em = 480/525 nm'de uç nokta modunda ve ortam varlığında ölçün. Tüm ölçümlerden boş okumaları çıkarın ve deney kontrolünden kat değişimini belirleyin.

Dikkat Edilmesi Gerekenler

1. Arka plan gürültüsünü azaltmak için hücreleri DCFH-DA ile inkübe ettikten sonra yıkayın.
2. Olası hataları önlemek için inkübasyondan sonra mümkün olan en kısa sürede floresans ölçümü yapılması önerilir.
3. Kendi güvenliğiniz ve sağlığınız için lütfen operasyon sırasında laboratuvar önlüğü ve tek kullanımlık eldiven giyin.
4. Sadece araştırma amaçlıdır!