Puromisin, Streptomyces alboniger'in fermantasyonu ve metabolizması ile üretilen, protein sentezini inhibe ederek Gram pozitif bakterileri, çeşitli hayvan ve böcek hücrelerini öldüren bir aminoglikozit antibiyotiktir. Puromisin bazı durumlarda E. coli'ye karşı etkilidir. Mekanizma şudur: puromisin aminoil-TrNA moleküllerinin 3' terminalinin bir analoğudur, ribozomun A bölgesine bağlanabilir ve uzatılmış peptit zincirine dahil edilebilir. Puromisin A bölgesine bağlandıktan sonra, sonraki reaksiyonlara katılmaz, bu da protein sentezinin erken sonlanmasına ve puromisin içeren olgunlaşmamış polipeptitlerin C-terminusta salınmasına neden olur.

Puromisin üreten Streptomyces alboniger suşunda bulunan pac geni, puromisine direnç kazandıran bir puromisin N-asetiltransferaz (PAC) kodlar. Bu özellik artık pac gen plazmidlerini taşıyan memeli stabil transfekte hücre hatlarını taramak için yaygın olarak kullanılmaktadır.

Puromisinin stabil hücre transfeksiyonlarının seçiminde genel uygulaması lentiviral vektörlerin özellikleriyle ilişkilidir. Ticari lentiviral vektörlerin çoğu artık pac genini taşımaktadır. Bazı özel durumlarda puromisin, pac gen plazmidini taşıyan E. coli suşlarının transformasyonunu taramak için de kullanılabilir.

Bu ürün hücre kültürü için uygundur, yaygın çalışma konsantrasyonu 1-10 µg/mL'dir.

Ayrıca Yeasen firması, farklı bir durumda olan ancak aynı işlevi gören puromisin'i (kat# 60209ES) çözelti formunda da üretmektedir.

Özellikler

Saflık≥%98

Uygulamalar

Hücre kültürü için uygundur

Spac genini taşıyan plazmidleri taşıyan, creen'e özgü memeli, stabil olarak transfekte edilmiş hücre suşları

Ekran , pac gen plazmidini taşıyan dönüştürülmüş E. coli suşları

Özellikler

Bileşenler

Nakliye ve Depolama

The Püromisin Dihidroklorür Ürünler -15℃'de saklanmalıdır ~ -25℃ için 2 Yıllar.

Talimatlar

1. Önerilen çalışma konsantrasyonu

Memeli hücreleri: 1-10 μg/mL için optimum konsantrasyonun öldürme eğrisi ile belirlenmesi gerekir.

Escherichia coli: LB agar ortamı, %125 konsantrasyonda pac geni ile stabil şekilde dönüştürülmüş Escherichia coli'yi taramak için kullanıldı μgr/mL.

Not: Puromisin kullanılarak stabil E. coli suşlarının taranması hassas pH ayarlaması gerektirir.

Önerilen konsantrasyonlar puromisin hidroklorür

2. Çözünme yöntemi

Puromisin'i damıtılmış suda eriterek 50 mg/mL'lik bir stok çözeltisi hazırlayın. 0,22'lik bir filtreden geçirilerek sterilizasyondan sonra μm filtre membranı, alikot ve -25 ila -15'te saklayın℃Alternatif olarak, 10 mg/mL'lik bir depolama çözeltisi hazırlamak için metanolde çözülebilir.

3. Belirlenmesi puromisin öldürme eğrisi (örnek olarak shRNA transfeksiyonu veya lentivirüs transdüksiyonu ele alınır)

Etkili tarama konsantrasyonu puromisin hücre tipi, büyüme durumu, hücre yoğunluğu, hücre metabolizması ve hücre döngüsü pozisyonu ile ilişkilidir. Stabil bir şekilde ifade eden shRNA hücre hatlarını taramak için, transfekte edilmemiş/transdüksiyon edilmiş hücreleri öldüren minimum puromisin konsantrasyonunu belirlemek kritik öneme sahiptir. İlk kez deney yapan müşterilerin kendi deneysel sistemlerine uygun bir öldürme eğrisi oluşturmaları önerilir.

1) 1. Gün: 24 kuyulu plaka %5 yoğunlukta plakalanır-8×104 hücre/kuyu ve sonraki gradyan deneyleri için yeterli sayıda kuyu plakalanır. Hücreler 37 °C'de bir gece inkübe edildi℃.

2) 2. Gün: A) Tarama ortamını hazırlayın: puromisin'in farklı konsantrasyonlarını içeren taze ortam (örneğin 0-15 μg/mL, en az 5 gradyan); B) Taze hazırlanmış tarama ortamını bir gecelik inkübasyondan sonra hücrelere koyun; Daha sonra hücreler 37 °C'de inkübe edilir℃.

3) 4. Gün: Taze seçilim ortamıyla değiştirin ve hücre canlılığını gözlemleyin.

4) Hücrelerin büyüme durumuna bağlı olarak 2-3 günde bir taze seçilim ortamına geçin.

5) Antibiyotik taramasının başlangıcından itibaren 4-6 gün içinde transfekte edilmemiş veya tüm transfekte edilmemiş hücreleri öldürmede etkili olan en düşük ilaç konsantrasyonunu belirlemek için hücreler günlük olarak izlenerek canlı hücre oranı gözlemlendi.

4. Memelilere Stabil Transfekte Edilmiş Hücre Hatlarının Taranması

Pac genini içeren plazmidin transfeksiyonundan sonra hücreler, stabil transfektantları seçmek için puromisin içeren bir ortamda çoğaltıldı.

1) Transfeksiyondan 48 saat sonra hücreler (orijinal veya seyreltilmiş) uygun konsantrasyonda puromisin içeren taze besiyerinde kültüre edilir.

Not: Antibiyotikler hücreler aktif olarak bölündüğünde en etkilidir. Hücreler çok yoğunsa, antibiyotiklerin etkinliği önemli ölçüde azalacaktır. Hücreleri %25'ten fazla olmayan bir yoğunluğa plakalamak en iyisidir.

2) Kültür ortamını çıkarın ve değiştirin. puromisin Her 2-3 günde bir.

3) Hücresel odaklar taramadan 7 gün sonra değerlendirilir. Lezyonlar konak hücre hattına ve transfeksiyon tarama verimliliğine bağlı olarak ek bir hafta veya daha fazla sürebilir.

Not: Hücre büyüme durumunu her gün gözlemleyin. Puromisin taraması en az 48 saat gerektirir ve puromisin etkili konsantrasyonunun tarama süresi genellikle 3-10 gündür.

4) 5-10 dirençli klonu 35 mm Petri kabına aktarın ve yerleştirin ve 7 gün boyunca seçilim ortamıyla kültürlemeye devam edin. Bu zenginleştirme kültürü gelecekteki sitotoksisite deneyi için hazırlık amaçlıdır.

Belgeler:

Güvenlik Bilgi Formu

60210_MSDS_HB220421_TR.pdf

Kılavuzlar

60210_Manuel_HB250114_TR.pdf

Alıntılar ve Referanslar:

[1] Furge KA. ve diğerleri, 2001. Met reseptör tirozin kinazının inhibisyonu yoluyla Ras aracılı tümör oluşumunun ve metastazın baskılanması. PNAS 98:10722-7.

[2] Díaz J. ve diğerleri, 2014. Rab5, Caveolin-1 destekli Rac1 aktivasyonu, göçü ve invazyonu için metastatik kanser hücrelerinde gereklidir. J Cell Sci. 127:2401-6.

[3] Rössger K. ve diğerleri, 2013. Sentetik beyin-dopamin arayüzü ile ödül bazlı hipertansiyon kontrolü. PNAS, 110:18150-5.

[4] Kamer I. ve diğerleri, 2005. Proapoptotik BID, DNA hasarı yanıtında bir ATM efektörüdür Hücre. 122:593-603.

[5] Charnaux N. ve diğerleri, 2005. RANTES (CCL5), HeLa hücrelerinden ve formlarından CCR5'e bağlı olarak hızlandırılmış bir syndecan-1 (CD138) ve syndecan-4 atılımını başlatır.

[6] Gao J, Zhao N, Knutson MD, ve diğerleri. Kalıtsal Hemokromatozis Proteini, HFE, HepG2 Hücrelerinde Zip14'ün Aşağı Düzenlenmesi Yoluyla Demir Alımını Engeller[J]. Biyolojik Kimya Dergisi, 2008, 283(31):21462-8.

[7] Huang J, Dibble CC, Matsuzaki M, ve diğerleri. TSC1-TSC2 kompleksi mTOR2'nin düzgün aktivasyonu için gereklidir[J]. Moleküler ve Hücresel Biyoloji, 2008, 28(12):4104-4115.

[8] Nasser MW, Datta J, Nuovo G, ve diğerleri. Nasser MW, Datta J, Nuovo G, Kutay H, Motiwala T, Majumder S, Wang B, Suster S, Jacob ST, Ghoshal K Akciğer kanserinde mikro-RNA-1'in (miR-1) aşağı düzenlenmesi. Akciğer kanseri hücrelerinin tümör oluşturma özelliğinin baskılanması ve miR-1 tarafından doksorubisin kaynaklı apoptoza karşı duyarlılıklarının artırılması. J Biol Chem 283: 33394-33405[J]. Biyolojik Kimya Dergisi, 2008, 283(48):33394-33405.

[9] Paatero AO, Hilkka T, Happonen LJ, ve diğerleri. Maya ve memeli genomlarına bakteriyofaj Mu entegrasyonu[J]. Nükleik Asit Araştırması, 2008, 36(22): e148-e148.

[10] Zhang D, ve diğerleri. Kanonik olmayan bir cGAS-STING-PERK yolu, senesans ve organ fibrozu için kritik olan translasyonel programı kolaylaştırır. Nat Cell Biol. 2022 Mayıs;24(5):766-782. doi: 10.1038/s41556-022-00894-z. Epub 2022 Mayıs 2. PMID: 35501370.

[11] Lu T, ve diğerleri. HNSCC'den türetilen küçük ekstraselüler veziküllerdeki CD73, mikroçevredeki makrofajlar tarafından aracılık edilen tümörle ilişkili immünosupresyonu tanımlar. J Extracell Vesicles. 2022 Mayıs;11(5): e12218. doi: 10.1002/jev2.12218. PMID: 35524455; PMCID: PMC9077142.

[12] Chen S, ve diğerleri.Ubiquitin-spesifik proteaz 32'nin glioblastomada bir onkogen olarak tanımlanması ve altta yatan mekanizmalar. Sci Rep. 2022 Apr 19;12(1):6445. doi: 10.1038/s41598-022-09497-y. PMID: 35440702; PMCID: PMC9018837.

[13] Han L, vd. Uterus globulin ilişkili protein 1 (UGRP1), Streptococcus pneumoniae enfeksiyonu sırasında yeni bir inflamasyon yolunu desteklemek için podoplanini (PDPN) bağlar. Clin Transl Med. 2022 Haziran;12(6): e850. doi: 10.1002/ctm2.850. PMID: 35652821; PMCID: PMC9161880.

[14] Sun Q ve diğerleri. MORTALIN-Ca2+ ekseni, yaygın büyük B hücreli lenfomada doğuştan gelen rituksimab direncini yönlendirir. Cancer Lett. 2022 Tem 1; 537:215678. doi: 10.1016/j.canlet.2022.215678. Epub 2022 Nis 18. PMID: 35447282.