G418 Sülfat, Geneticin Sülfat olarak da bilinir, bir amino-glikozit antibiyotiktir ve yapısal olarak Gentamisin B1'e benzer. 80s ribozomuna bağlanarak ve uzama adımlarını bloke ederek protein sentezine müdahale eder. G418 Sülfat, bakteriler, maya, yüksek bitki ve memeli hücreleri ile protozoalar ve solucanlar dahil olmak üzere hem prokaryotik hem de ökaryotik hücreler için toksiktir. Transpozon Tn601 (903) veya Tn5'te bulunan direnç geni (çoğunlukla neo), bakterilerden türetilmiştir, ancak ökaryotik hücrelerde ifade edilebilir. Direnç geni, direnç genini taşıyan prokaryotik veya ökaryotik hücrelerin kültürünü taramak ve sürdürmek için kullanılabilen G418 direncini elde etmek için gen rekombinasyon teknikleri yoluyla hücrelere sokulabilir.

Memeli hücrelerinde neo, ökaryotik genoma entegre edildikten sonra amino-glikozit 3' -fosfotransferazın (APH (3') II) ifadesini kodlar. Bu enzim, G418'in amino veya hidroksil fonksiyonunu kovalent olarak değiştirerek ve antibiyotik-ribozom etkileşimini inhibe ederek antibiyotiği etkisiz hale getirir ve hücreye G418 direnci kazandırır. Stabil hücre hattı deneylerinin taranmasında, dirençli olmayan hücreleri öldürmek için minimum etkili konsantrasyonu belirlemek amacıyla öldürme eğrileri (doz-tepki eğrileri) oluşturulmalıdır.

Bitki hücrelerinde direnç, nptII gen dirençli plazmidinin transfeksiyonu ile elde edilebilir. NptII geni ayrıca G418, kanamisin ve palomisin dahil olmak üzere çeşitli antibiyotikleri inaktive eden bir enzim olan aminoglikozid fosfotransferazı kodlar.

Özellikler

Saflık≥%98

Fabrika seri üretim modunu kullanarak standartlaştırılmış üretim

Doku kültürünün moleküler biyoloji ve biyokimyasal deneysel araştırma alanlarında kullanılabilen geniş uygulama yelpazesi

İşbirliği platformu tümünü kapsıyor

Ürün kalitesinin istikrarını sağlamak için partiler arasındaki fark %1'in altında kontrol edilir.

Uygulamalar

Stabil transfekte edilmiş hücre hatlarının taranması

Özellikler

Bileşenler

Nakliye ve Depolama

The G418 Sülfat (Geneticin) Ürünler -15℃'de saklanmalıdır ~ -25℃ için 3 Yıllar.

Talimatlar

1. G418 depolama solüsyonunun hazırlanması (50 mg/mL, aktif konsantrasyon)

1) Etkinlik birimlerinin dönüştürülmesi

Dönüşüm şu formüle göre gerçekleştirildi: (1000/A0) ×A1=A2

A0: Partiden partiye değişen G418'in potens değeri. Parti kalite raporuna veya şişe üzerindeki etikete bakın.

A1: İstediğiniz aktif G418 konsantrasyonu.

A2: G418'in gerçek konsantrasyonu.

Örneğin, partinin G418 aktivite değeri 750 U/mg ve G418'in aktif konsantrasyonu 50 mg/mL ise, hazırlanması gereken gerçek toz konsantrasyonu 1000/750×50 mg/mL=66,67 mg/mL'dir. 10 mL G418 saklama solüsyonu (aktif konsantrasyon, 50 mg/mL) hazırlanırsa, 666,7 mg toz tartılmalıdır.

2) Sterilizasyon ve koruma

Yukarıdaki dönüşümle elde edilen gerçek tozu tartın ve tamamen çözünmesi için 10 mL steril deiyonize su ekleyin.

0,22 μm iğne filtreyi 5 mL steril deiyonize su ile önceden ıslatın ve ardından G418 çözeltisini filtrasyon yoluyla sterilize edin.Sterilize edilmiş G418 solüsyonunu alikotlara bölün ve -20℃'de saklayın.

Not: ① Bulanık çözeltiyi filtrelemeyin, çünkü çözelti tamamen çözünmemiştir, filtreleme işlemi ilaç kaybına neden olur ve nihai çözeltinin aktivitesini azaltır. ② Saklama çözeltisini hazırlamak için kültür ortamı, fosfat çözeltileri veya organik çözücüler kullanılması önerilmez.

2. Yaygın olarak kullanılan tarama konsantrasyonu

Genel olarak, başlangıçta tarama transformatörleri için yüksek konsantrasyonda G418 gerekir ve kültürü korumak için düşük konsantrasyon kullanılır. Büyüme koşulları, hücre tipleri ve diğer çevresel faktörler G418'in etkili dozajını etkileyebilir, bu nedenle öldürme eğrisi (doz-cevap eğrisi) aracılığıyla optimum tarama konsantrasyonunun belirlenmesi önerilir.

Genel olarak memeli hücrelerinde tarama aralığı 200-2000 μg/mL, Bitki hücrelerinde 10-100 μg/mL, Maya hücrelerinde 500-1000 μg/mL’dir.

Hücre Hattı Deneysel Verileri

3. Öldürme eğrisinin oluşturulması

Not: Hedef proteinlerin stabil ekspresyonuna sahip hücre hatlarını taramak için, transfekte edilmemiş konak hücrelerini öldürebilecek minimum antibiyotik konsantrasyonunu belirlemek gerekir. Bu, bir öldürme eğrisi (doz-tepki eğrisi) oluşturularak elde edilebilir. En az altı konsantrasyon seçilmelidir. G418, mitotik hücreleri tedavi ederken en aktiftir, bu nedenle hücrelerin G418 eklenmeden önce bir süre kültürlenmesi gerekir.

1) 1. Gün: Dönüştürülmemiş hücreler, 37℃'de %20-25 hücre yoğunluğuna sahip uygun bir kültür plakasına yerleştirilir ve CO2'de bir gece boyunca kültüre edilir.₂;

Not: Canlılığı tespit etmek için daha yüksek yoğunluk gerektiren hücreler için aşılama miktarı artırılabilir.

2) G418 konsantrasyon gradyanını hücre tipine göre uygun aralıkta ayarlayın. Memeli hücreleri 0, 50, 100, 200, 400, 800, 1000 μg/mL olarak ayarlanabilir.

3) 2. Gün: Eski ortamı çıkarın ve yerine karşılık gelen ilaç konsantrasyonunu içeren taze hazırlanmış bir ortam koyun. Her konsantrasyon için üç paralel yapın.

4) Daha sonra her 3-4 günde bir G418 içeren taze besiyeri ile değiştirin.

5) Uygun konsantrasyonu belirlemek için canlı hücre sayımları sabit bir döngüde (örneğin, her 2 günde bir) gerçekleştirilir. Kararlı transfeksiyon hücre taraması için çalışma konsantrasyonu olarak, hücrelerin çoğunu ideal gün sayısı (genellikle 7-10 gün) içinde öldüren minimum konsantrasyonu seçin.

4. Stabil transfekte hücrelerin taranması

1) Transfeksiyondan 48 saat sonra, uygun konsantrasyonda G418 kültür ortamı alt kültür (doğrudan alt kültür veya seyreltilmiş alt kültür) için kullanıldı.

Not: İyi tarama sonuçları elde etmek için hücrelerin en fazla %25 oranında seyreltilmesi önerilir.

2) İlaç içeren tarama ortamını 3-4 günde bir değiştirin.

3) Taramadan 7 gün sonra hücre koloni oluşumunu ölçün. Koloni oluşumu konak hücre tipine, transfeksiyona ve tarama etkinliğine bağlı olarak bir hafta veya daha fazla sürebilir.

4) 5-10 dirençli klon seçilerek 35 mm hücre kültürü plakalarına aktarıldı ve 7 gün boyunca ilaç içeren tarama besiyerinde kültüre edildi.

5) Normal ortamla değiştirin.

Belgeler:

Güvenlik Bilgi Formu

60220_MSDS_HB220421_TR.pdf

Kılavuzlar

60220_Manuel_HB250115_TR.pdf

Rakamlar

Şekil 1.Genomisinin farklı partiler arasındaki etkili konsantrasyonunun kararlılık testi ve doğrulanması

Deneysel suş: E. coli

G69 ve G99 iki farklı partidir

Genomisinin kullanım konsantrasyonu sırasıyla 8 mg/L, 12 mg/L ve 16 mg/L olarak belirlendi ve etkili minimum konsantrasyon 16 mg/L olarak belirlendi ve bu da çeşitli bakterilerin büyümesini mükemmel şekilde engelledi. İki partinin performansı tutarlıydı.