Streptomyces hygroscopicus tarafından sentezlenen bir aminoglikozit antibiyotik olan Higromisin B, 70S ribozomal translokasyonu engelleyerek ve mRNA şablonunun yanlış okunmasına neden olarak protein sentezini inhibe eder, böylece prokaryotları (bakteriler gibi), ökaryotları (mayalar, mantarlar gibi) ve daha yüksek memeli ökaryotlarını öldürür.

Escherichia coli'den türetilen higromisin direnç genleri (hyg veya hph), higromisin B'yi biyolojik olarak aktif olmayan fosforlanmış bir ürüne detoksifiye eden higromisin B fosfotransferazını kodlar ve bu da onu hitromisin direnç genleriyle başarılı bir şekilde transfekte edilmiş prokaryotik veya ökaryotik hücrelerin taranması ve kültürlenmesi için mükemmel bir seçici belirteç haline getirir. Ek olarak, farklı etki biçimleri nedeniyle, Higromisin B genellikle çift dirençli hücre hatlarının seçimi için G418 veya Blasticidin S ile birlikte kullanılır. Higromisin B, viral enfeksiyon nedeniyle artan zar geçirgenliğine sahip hücrelere seçici olarak nüfuz ettiği ve translasyonu engellediği için antiviral bir ajan olarak da kullanılabilir. Ayrıca hayvan yemiyle karıştırılarak böcek kovucu olarak da etki edebilir.

Ayrıca Yeasen firmasının aynı işlevi gören ancak farklı bir durumda olan çözelti formunda Higromisin B (kat# 60224ES)'yi de bulunmaktadır.

Özellikler

Fabrika seri üretim modunu kullanarak standartlaştırılmış üretim

Uygulamalar

Stabil transfekte edilmiş hücre hatlarının taranması

Özellikler

Bileşenler

Nakliye ve Depolama

The Higromisin B Ürünler aşağıdaki koşullarda saklanmalıdır: -15℃ ~ -25℃ için 2 Yıllar.

Talimatlar

1. Stok solüsyonunun hazırlanması (50 mg/mL)

0,5 g Higromisin B'yi tartın ve 10 mL 1'e ekleyin.×PBS, pH 7.4. İyice çözündükten sonra 0,22'lik bir filtreden geçirin. μsterilize etmek için filtreleyin. Tek kullanımlık küçük hacimlere bölün (örneğin, 1 mL) ve -25 ila -15 °C'de saklayın℃veya 2 ile 8℃.

2. Yaygın olarak kullanılan tarama konsantrasyonu

Kararlı transfer suşlarını taramak için kullanılan higromisin B'nin çalışma konsantrasyonunun hücre tipine, ortama, büyüme koşullarına ve hücre metabolizma hızına bağlı olarak değişmesi gerekir; önerilen konsantrasyonlar 50-1000'dir. μg/mL. İlk deneysel sistem için, optimum tarama konsantrasyonunu belirlemek amacıyla bir öldürme eğrisi (kill curve), yani doz reaktivite eğrisi önerilir.

Genel olarak memeli hücreleri: 50-500 μg/mL; Bakteriyel/bitki hücreleri: 20-200 μg/mL; Mantarlar: 300-1000 μgr/mL.

3. Öldürme eğrisinin oluşturulması

Not: Stabil hücre hatlarını taramak için, transfekte edilmemiş konak hücrelerini öldürebilecek minimum antibiyotik konsantrasyonunu belirlemek gerekir. Bu, bir öldürme eğrisi (doz-tepki eğrisi) oluşturularak elde edilebilir. En az beş konsantrasyon ayarlanmalıdır.

1) 1. Gün: Dönüştürülmemiş hücreler, %20-25 hücre yoğunluğunda uygun bir kültür plakasına yerleştirilir ve bir gece boyunca kültüre edilir.

Not: Canlılığı tespit etmek için daha yüksek yoğunluk gerektiren hücrelerde aşılama hücrelerinin miktarı arttırılabilir.

2) Konsantrasyon gradyanını hücre tipine göre uygun aralıkta ayarlayın.Memeli hücresi 50, 100, 250, 500, 750, 1000 olarak ayarlanabilir μg/mL. Higromisin B solüsyonunu 1:10 oranında deiyonize su veya PBS tamponuyla 5 mg/mL'ye seyreltin. Daha sonra solüsyonu aşağıdaki tabloya göre ilgili çalışma konsantrasyonuna seyreltin.

3) 2. Gün: İlacın karşılık gelen konsantrasyonunu içeren taze hazırlanmış bir ortamla değiştirin. Her konsantrasyon için üç paralel örnek yapın.

4) Daha sonra her 3-4 günde bir ilaç içeren taze besiyeri ile değiştirilir.

5) Transfekte edilmemiş hücrelerin büyümesini engelleyen uygun konsantrasyonu belirlemek için sabit aralıklarla (örneğin her 2 günde bir) canlı hücre sayımları yapın. Kararlı transfektan seçimi için çalışma konsantrasyonu olarak, ideal gün sayısı (genellikle 7-10 gün) içinde hücrelerin büyük çoğunluğunu öldürebilecek en düşük konsantrasyonu seçin.

4. Memelilere Stabil Transfekte Edilmiş Hücre Hatlarının Taranması

1) Transfeksiyondan 48 saat sonra hücreler, uygun konsantrasyonda (doğrudan veya seyreltilmiş) higromisin B içeren tarama ortamıyla alt kültüre alındı.

Not: Antibiyotikler aktif olarak bölünen hücrelerde en iyi şekilde çalışır. Hücreler çok yoğunsa, antibiyotik hücreleri öldürmez. Hücreleri, hücrelerin %25'ten fazla birleşmeyecek şekilde bölün.

2) Tarama ortamını 3-4 günde bir değiştirin.

3) Taramadan 7 gün sonra hücre koloni oluşumunu ölçün. Koloni oluşumu konak hücre tipine, transfeksiyona ve tarama etkinliğine bağlı olarak bir hafta veya daha fazla sürebilir.

4) 5-10 dirençli klon seçilip 35 mm hücre kültürü plakalarına aktarılır ve 7 gün boyunca ilaç içeren tarama besiyerinde kültüre edilir.

5) Kültür için ilaçsız taze besiyeri ile değiştirin.

Belgeler:

Güvenlik Bilgi Formu

60225_MSDS_HB220420_TR.pdf

Kılavuzlar

60225_Manuel_HB250115_TR.pdf