Aureobasidin A, AbA, Basifungin, breomisin A olarak da bilinir, filamentöz mantar Aureobasidium Pullulans No. R106'dan izole edilen bir siklik ester peptit antibiyotiktir. Güçlü bir antifungal özelliğe sahiptir ve inositol fosforile seramid sentaz AUR1'in bir inhibitörüdür. Daha düşük konsantrasyonlarda (0,1-0,5 μg/mL) bile maya için toksiktir. Aureobasidin A'ya duyarlı mantar türleri arasında Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharces pombe, Candida glabrata, Aspergillus nidulans ve A. niger bulunur. Buna duyarlı mantar türleri arasında diş mayası (Saccharomyces cerevisiae), Schizaccharomyces darı (Schizosaccharomyces pombe), Candida glabrata (Candida glabrata), Aspergillus nest (Aspergillus nidulans) ve Aspergillus niger (A. niger) bulunur. Etki mekanizması, Aureobasidin A'nın mantar büyümesinin bağımlı olduğu inositol fosforamidit (inositol fosforilseramid, IPC) sentazın aktivitesini inhibe etmesi ve sfingolipid sentezine müdahale ederek suşu daha da öldürmesidir. Saccharomyces cerevisiae'den AUR 1 geni ve homologisi olan A. sinensis'ten AURA geni gibi IPC sentazlarını kodlayan daha fazla gen çalışılmıştır. Bu kodlayıcı genlerin susturulması, suşları Aureobasidin A'ya dirençli hale getirir, örneğin AUR 1-C geni.

Aureobasidin A, pozitif klonların taranması için bir ilaç seçimi belirteci olarak oldukça uygundur. Aureobasidin A direnci ayrıca maya tek hibrit ve iki hibrit çalışmalarında ideal bir raportördür. Bu ürün, 1 mg/mL konsantrasyonda metanolde çözülmüş bir Aureobasidin A çözeltisidir.

Özellikler

Saflık≥%97

Fabrika seri üretim modunu kullanarak standartlaştırılmış üretim

Uygulamalar

Maya iki hibrit çalışmaları

Maya tek hibrit çalışmaları

Sıkı maya ilacı seçim belirteci

Aureobasidin A direnci, maya hibridizasyon çalışmaları için ideal bir raporlayıcıdır

Özellikler

Bileşenler

Nakliye ve Depolama

The Aureobasidin A（Aba） Ürünler aşağıdaki koşullarda saklanmalıdır: -15℃ ~ -25℃ için 2 Yıllar.

Talimatlar

1. Çalışma konsantrasyonu

Lütfen belirli konsantrasyonlar için ilgili literatüre başvurun ve kendi deneysel koşullarınıza (deneysel amaç, hücre tipi, kültür özellikleri vb.) göre araştırın ve optimize edin.

2. Hücre deneyi (in vitro deney)

Aureobasidin A, hem seramid zehirlenmesi hem de temel inozitolfosforilseramidlerin yoksunluğu yoluyla maya hücrelerinin büyümesini durdurur^[1].

Her CArG-kutusu motifinin üçlü tandem tekrarları sentezlendi. Tüm DNA parçaları uygun restriksiyon bölgeleri kullanılarak Y1H vektörü pAbAi'ye (Clontech, Mountain View, ABD) klonlandı. Daha sonra, bir araya getirilen her pAbAi yapısı BstbI ile doğrusallaştırıldı ve Maya Transformasyon Sistemi 2 Kılavuzu'na (Clontech, Mountain View, ABD) göre Saccharomyces cerevisiae Y1HGold suşuna dönüştürüldü. İstenen DNA parçasını taşıyan klonlar, %100 konsantrasyonda Aureobasidin A ile takviye edilmiş sentetik urasil bırakma ortamında otomatik aktivasyon için tarandı.–900 ng/mL, belirtildiği gibi (Clontech, Mountain View, ABD)^[2].

SlBES1 genlerinin açık okuma çerçeveleri (ORF'ler) çoğaltıldı ve pGBKT7-GAL4BD plazmidine bağlandı. Füzyon GAL4BD-SlBES1 yapıları daha sonra Y2H Altın maya hücrelerine dönüştürüldü. SD/−Maya transformantlarını kültüre etmek için Trp besiyeri plakaları kullanıldı.The α- transformantların galaktozidaz aktivitesi X- ile tanımlandıα-gal ve AUR1-C ifadesi Aureobasidin A ile tarandı^[3].

3. Çeşitli mayalar için Aureobasidin'in minimum inhibitör konsantrasyonları

4. İşletim Prosedürleri (AbA'ya dirençli maya dönüşüm sistemi için)

1) 50 mL YPD besiyerine 0,5 mL bir gece bekletilmiş maya kültürü ekleyin (bileşimi: 1 L sıvı besiyerinde 10 g maya özütü, 20 g polipepton, 20 g D-glikoz bulunur; katı besiyeri için ek olarak %2 agar ekleyin).

2) 30'da kuluçkaya yatırın℃ yaklaşık 6 saat boyunca, OD660 1-2 olana kadar. Diploidler kullanıldığında, OD660'ın 2-4 olduğunu ölçün.

3) 1.000'de santrifüj×5 dakika boyunca g.

4) Peleti 10 mL Çözelti A'da (bileşim: 100 mM Lityum asetat, 10 mM Tris-HCl pH 7,5, 1 mM EDTA) yeniden süspanse edin, ardından 1.000'de santrifüjleyin.×5 dakika boyunca g.

5) EOD660 değeri 150 olana kadar pelleti Çözelti A'da bekletin.

6) Hücre süspansiyonunun 100 µL'sini bir tüpe alın ve 30°C'de inkübe edin.℃ 1 saat boyunca.

7) 5 µg vektör (dairesel veya doğrusal DNA) ve 150 µg Taşıyıcı DNA (100 °C'de ısıtılmış) ekleyin℃ (10 dakika kadar pişirilip daha sonra hemen soğutulur).

Not: pAUR101, dönüşüm için doğrusal DNA gerektirir. Dairesel DNA kullanmak, dönüşüm verimliliğini azaltacaktır veya hatta başarısızlığa yol açabilir. pAUR112 ve pAUR123, dönüşüm için tam plazmid DNA'sı gerektirir.

8) 850 µL Çözelti B ekleyin (bileşimi: 40 g Polietilen Glikol 4000’i 100 mL Çözelti A’da çözün ve iyice karıştırın, kullanmadan önce taze olarak hazırlayın) ve yavaşça karıştırın.

9) 30'da kuluçkaya yatırın℃ 30 dakika sonra 42 dakika℃ 15 dakika boyunca.

10) Oda sıcaklığında 10 dakika bekletin.

11) 5000 rpm'de 1 dakika santrifüjleyin ve peleti 5 mL YPD besiyerinde yeniden süspanse edin.

12) 30'da kuluçkaya yatırın℃ 6 saatten gece boyunca.

13) 5.000-10.000 rpm'de santrifüjleyin ve peleti 1-10 mL %0,9 NaCl'de tekrar süspanse edin.

14) Hücre süspansiyonunun 100 µL'sini YPD seçici ortam plakalarına (suş türüne bağlı olarak belirli bir AbA konsantrasyonu içeren) yerleştirin.30'da kuluçkaya yatırın℃ Dönüşüm tamamlanana kadar 3-4 gün.

15) Pozitif transformantları seçin ve/veya dönüşüm verimliliğini belirleyin (plazmit DNA'sının mikrogramı başına dönüştürülen koloni sayısı olarak ifade edilir).

Belgeler:

Güvenlik Bilgi Formu

60231_MSDS_HB220420_TR.pdf

Kılavuzlar

60231_Manuel_HB250116_TR.pdf

Rakamlar

Şekil 1. Maya plakası büyüme tablosu

Deneysel suş:GS115

Kullanım miktarı: 0,05 μg/mL、0,1 μg/mL、0,5 μg/mL、1 μg/mL

Tedavi: 3-5 Gün3'te s0℃

Üst sırada yeasen ürünü, alt sırada ise T* markası yer alıyor.