qPCR实验有时看似简单，有时又很困难。引物设计完成后，像PCR一样一步步加入qPCR样品，即可在机上完成实验。下面介绍几种染料法qPCR实验中常见的问题，并给出可能的原因和解决方法，希望可以帮助大家解决qPCR实验中的烦恼。

1.什么是qPCR？
2. qPCR扩增曲线异常
3. qPCR熔解曲线异常
4. 订购信息
5.相关产品
6.关于阅读

1.什么是qPCR？

聚合酶链式反应技术（PCR）自发明以来，由于其简便、廉价、可靠、快速、灵敏度高等特点，PCR可能是分子生物学中应用最广泛的技术。qPCR是由PCR技术发展起来的一项技术，在DNA扩增过程中，用荧光染料检测每个PCR循环后产物总量的方法，不仅具有PCR的快速性和灵敏度，还具有特异性强、实时监测、可重复准确定量等优点。qPCR是在PCR过程中利用定量实时PCR扩增装置即qPCR仪实时监测核酸扩增产物的技术。qPCR通过对Ct值和标准曲线的分析，实现对起始模板的定量分析。1992年，日本人Higuchi首次提出了“实时荧光定量PCR技术”。 1996年美国生物公司推出全球第一台荧光定量PCR仪，该仪器由PCR扩增热循环系统、荧光检测光学系统以及计算机及应用软件组成，可通过荧光染料或荧光探针实时监测核酸扩增产物，通过数学函数关系，结合结果分析软件实现待测样本初始模板量的计算。因此实时荧光定量PCR技术得到了广泛的应用。qPCR的荧光标记方法分为基于SYBR Green I染料法的荧光染料镶嵌法、基于Taqman探针法(Cycling Probe、Molecular Bracon等)的荧光探针法、淬灭染料引物法。

qPCR实验有时感觉简单，有时又感觉困难。引物设计完成后，像PCR一样一步步加入qPCR样品，就可以上机完成实验了。但实验过程中需要注意很多小细节，比如管壁上不能挂液体，管内不能有气泡，尽量减少管壁、管盖等直接接触，以减少实验误差或者奇怪的实验结果。小毅整理了几种染料法qPCR实验中常见的问题，并给出了可能的原因和解决方法，希望可以帮助大家解决qPCR实验中的烦恼。

2. qPCR扩增曲线异常

2.1 扩增曲线对数图基线期异常

图 1. 扩增图

可能的原因：

基线设置不当。

解决方案：

建议增加基线的端点值。调整示例图如下。

图 2. 扩增图

2.2 扩增曲线对数图曲线分割

图 3. 扩增图

可能的原因：

基线设置得太高。

解决方案：

建议降低基线端点值，调整示例图如下。

2.3 扩增曲线线性图不光滑

图 4. 扩增图

可能的原因：

1）PCR反应管盖不严，反应液泄漏。
2）带挂壁的PCR反应液。
3)仪器未经过校准（包括自动校准或者ROX校准）。
4)体系中抑制剂较多，导致荧光不稳定。
5)仪器过度使用导致荧光收集不稳定。

解决方案：

1）将管盖压紧。
2)充分混匀试剂，充分离心后小心地放入定量仪中。
3)校准仪器。
4)提高RNA纯度，选择合适的逆转录试剂。

2.4 放大曲线线性图在平台处呈锯齿状

图 5. 扩增图

可能的原因：

1）   RNA纯度差，杂质多。
2）   仪器使用时间过长。

解决方案：

1）   重新提取高质量RNA。
2）   稀释 RNA 模板以降低杂质的浓度。
3）   校准仪器。

2.5 扩增曲线的线性图未能达到平台期

图 6. 扩增图

可能的原因：

1）   模板浓度低（Ct值约为35）。
2）   扩增循环数太少。
3）   试剂扩增效率低（Ct值小，但也无法达到平台期）。

解决方案：

1）   增加模板的浓度。
2）   增加循环次数。
3）   增加镁²⁺ 专注。

2.6 扩增曲线线性图平台下垂

图 7. 扩增图

可能的原因：

1）   存在降解（扩增产物降解、SYBR 降解）。
2）   管盖未盖好，试剂挥发。
3）   cDNA浓度过高（Ct值太小，荧光阈值被拉高，下垂比较严重）。
4）   管内有气泡，然后它们消失。

解决方案：

1）   提高系统纯度。
2）   减少 cDNA 量（稀释模板）。
3）   降低基线的端点值。

2.7 扩增曲线中Ct值过大

图 8. 扩增图

可能的原因：

1）   模板数量少。
2）   扩增效率低。
3）   PCR 片段太长。
4）   反应体系中存在抑制剂。

解决方案：

1）   尽量减少稀释倍数或增加模板量，使Ct值落在15~30之间。
2）   优化反应条件，尝试三步扩增程序，或重新设计引物。
3）   PCR产物长度设计在100-150bp内，不建议超过300bp。
4）   复制更高纯度的模板。

2.8 扩增曲线重复性差

图 9. 扩增图

可能的原因：

1）   较大的尖峰误差。
2）   试剂和系统未充分混合。
3）   cDNA 拷贝数低。
4）   没有使用 Rox 校准。

解决方案：

1）   校准移液器。
2）   充分混合反应体系。
3）   模板浓度低，重复性差，4-6个化合物孔，1-2个偏差较大的值可以适当丢弃。
4）   最好使用Rox校准，如果所用的试剂不含Rox，则参考染料需要选择为None。

2.9 随机扩增曲线

图 10. 扩增图

可能的原因：

Rox浓度与模型不匹配。

解决方案：

将仪器上的参考染料设置从ROX改为NONE，观察扩增曲线是否恢复正常。

2.10 NTC 峰值

2.10.1 Ct>35，熔化曲线Tm值<80℃

图 11. 扩增图

可能的原因：

引物二聚化结果。

解决方案：

优化引物。

2.10.2 Ct值<35，NTC熔解曲线与基因熔解曲线峰形重叠

图 12. 扩增图

可能的原因：

反应体系污染。

解决方案：

逐一检查污染源。

3. qPCR熔解曲线异常

3.1 熔解曲线单峰但不尖锐

图 13. 熔解曲线图

可能的原因：

1）   与试剂成分、仪器型号有关。
2）   存在类似大小的片段的非特异性扩增。

解决方案：

1）   从峰开始到峰结束的温度跨度不高于 7°C。结果被认为是可用的，即单峰。
2）   采用高浓度琼脂糖电泳(如3％琼脂糖)辅助测定。

3.2 熔解曲线呈双峰状，下峰Tm在80℃之前

图 14. 解离曲线

可能的原因：

存在引物二聚体。

解决方案：

增加退火温度、降低引物浓度或重新设计引物。

3.3 熔解曲线呈双峰状，下峰Tm在80℃后

图 15. 解离曲线

可能的原因：

1）   引物特异性差导致非特异性产物的扩增。
2）   gDNA 污染。

解决方案：

1）   检查引物的特异性，如果较差则重新设计。
2）   经NRC阴性对照确认，如有，需重新制备模板。

3.4 熔解曲线峰杂乱

图 16. 熔解曲线图

可能的原因：

1）   反应体系受到污染。
2）   试剂暴露在强光或高温下会导致试剂失效。
3）   仪器长时间未校准。
4）   耗材与仪器不匹配。

解决方案：

1）   结合NTC和NRC结果来确认污染，建议逐一排除水、引物、酶和环境的污染。
2）   建议与新试剂做对比实验。
3）   建议定期进行仪器校准维护。
4）   确认相应仪器对耗材的要求。

3.5 熔化曲线前端的假峰

图 17. 熔解曲线图

可能的原因：

Rox 浓度与模型不匹配。

解决方案：

建议取消Rox校正，看看熔解曲线是否正常。

图 18. 熔解曲线图

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6.关于阅读

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