随着干细胞治疗和基于类器官的药物开发的进展，基底膜基质作为干细胞培养和类器官、3D细胞培养以及其他应用（包括血管生成、体内肿瘤发生实验等）的营养和支持载体发挥着至关重要的作用。Ceturegel™基底膜提取物是从Engelbreth-Holm-Swarm（EHS）小鼠肿瘤中提取的，富含细胞外基质蛋白，包括层粘连蛋白、IV型胶原蛋白、巢蛋白等。IGF、FGF和其他生长因子。在室温下，Ceturegel™基底膜基质聚合形成具有生物活性的三维基质。它可以在体内模拟细胞基底膜的结构、组成、物理性质和功能，有利于细胞的体外培养和分化，是一种很好的基质胶替代品。

1. Ceturegel™基底膜基质是什么？
2. Ceturegel™基底膜基质的作用是什么？
3. Ceturegel™基底膜基质的特点是什么？
4. Ceturegel™基底膜基质的广泛应用
5. 常见问题
6. Ceturegel™基底膜基质的选择指南 Yeasen

1. Ceturegel™基底膜基质是什么？

内皮细胞、上皮细胞、肌肉细胞和神经细胞相邻的基质形成连续的、分层的细胞外基质，称为基底膜。基底膜在发育和伤口愈合过程中会退化和再生。它不仅支持细胞和细胞层，而且还通过影响细胞粘附、迁移、增殖和分化（这是基底膜的功能）在组织形成中发挥重要作用。因此，可以说基底膜是转移性肿瘤细胞侵袭的主要屏障。

图 1. Ceturegel™ 基底膜基质

Ceturegel™ 基底膜基质由 Yeasen 不含LDEV（乳酸脱氢酶增强病毒），超低内毒素含量，并经过支原体检测，确保无支原体污染，包含基础浓度、高浓度、低生长因子等不同类型。

2. Ceturegel™基底膜基质的作用是什么？

Ceturegel™基底膜基质可用于制备各种要求的基底膜基质，可用于细胞信号传导研究，如生长因子在小鼠肾干细胞形成肾小管中的作用研究、小鼠乳腺上皮干细胞的基因表达研究、Transwell的肿瘤侵袭性实验等。同时可用于细胞形态、生化功能、迁移、感染、基因表达等研究。Ceturegel™基底膜基质可有效帮助上皮细胞和其他类型细胞的附着和分化，包括神经细胞、干细胞、哺乳动物上皮细胞、黑色素瘤细胞、血管内皮细胞、甲状腺细胞和毛囊细胞。同时，Ceturegel™基底膜基质还影响小鼠乳腺上皮细胞的蛋白质表达水平，支持周围神经再生。

图 2.Ceturegel™基底膜基质的主要应用方向

细胞迁移和侵袭详解：细胞迁移又称细胞爬行、移动或运动，是指细胞接收到迁移信号或感受到某种物质梯度后发生的运动。细胞迁移是细胞头部伪足伸长、新黏附建立、细胞体尾部回缩的交替过程。细胞迁移是正常细胞的基本功能之一，也是机体正常生长发育的生理过程。作为活细胞普遍存在的运动形式，它可以参与多种集体生理病理过程。如胚胎发育、血管生成、伤口愈合、免疫反应、炎症反应、动脉粥样硬化、癌症转移等。而细胞侵袭是指细胞通过细胞外基质从一个区域迁移到另一个区域的能力。细胞侵袭是正常细胞和癌细胞对化学和机械刺激的反应。细胞侵袭常发生在伤口愈合、血管生成、炎症、肿瘤细胞转移、组织异常浸润等过程中。

3. Ceturegel™基底膜基质的特点是什么？

安全性高：无LDEV（乳酸脱氢酶增加病毒）
浓度多样性：浓度范围在8~20mg/ml之间
良好的批次稳定性：严格的生产质检流程，确保批次间性能稳定
低内毒素：内毒素含量<8 EU/ml
污染检测：未检测到支原体、细菌和真菌残留
单批产量高：单批次产量在50L以上
兼容性：与任何类型的细胞培养基兼容

4. Ceturegel™基底膜基质的广泛应用

4.1 迁移和侵袭试验

检测细胞迁移侵袭能力的实验方法是Transwell实验，Transwell又称穿孔实验。由于小室有密集的孔洞，所以先将细胞悬浮液加入小室中，然后将小室放入24孔板中，加入完全培养基。细胞变形后通过小室上的孔洞，到达营养更丰富的小室外部，并黏附在外面。通过对小室外的细胞进行染色计数，可以判断细胞的迁移侵袭能力。Transwell的原理是将小室放在培养板中，小室称为上室，培养板称为下室。上下两层培养液用聚碳酸酯膜隔开，上层培养液加入上室，下层培养液加入下室。细胞在上室，由于膜的通透性，下层培养基的成分会影响上室的细胞。此外，还研究了下层培养基成分对细胞生长和运动的影响。
Ceturegel™基底膜基质在迁移和侵袭实验中的具体操作：将稀释的Ceturegel™基底膜基质加入到Transwell上室，将细胞接种在37°C、5% CO₂ 培养箱中培养24小时，4％多聚甲醛固定，0.1％结晶紫染色液染色，倒置相差显微镜下观察并计数细胞。

图3 细胞侵袭后结晶紫染色结果

4.2 血管生成

1）实验前一天，取出Ceturegel™ 从冰箱中取出 Matrigel 并将其放置在 4°C 冰箱中过夜以解冻，同时预冷所使用的耗材。
2) 实验前务必将 Ceturegel™ Matrigel 放在冰盒中。打开血管生成载玻片的无菌包装并取出载玻片。
3) 每孔加入10 μl Ceturegel™ Matrigel。注意加入Ceturegel™ Matrigel时枪头应垂直于内孔上方，防止Matrigel从上孔流出留下胶水残留。
4）先盖上载玻片，准备一个10cm的培养皿，放上浸过水的纸巾，做成湿盒。
5) 将载玻片放入培养皿中，盖上培养皿。将其放入 CO₂ 培养箱中，静置30分钟左右，待凝胶凝固，同时制备细胞悬浮液。
6) 将消化后的细胞制成密度为2*10⁵ 细胞/毫升并充分混合。
7) 取出已凝固成凝胶的含有血管的载玻片。向每孔中加入50 μl细胞悬浮液，注意保持枪头垂直于上孔，不要接触下孔的凝胶。
8) 加入细胞培养基，盖上盖子，静置。一段时间后，所有细胞都会沉到 Matrigel 表面。

图4.血管生成结果图

免疫荧光染色

1) 小心地从孔中除去培养基，不要接触胶水或细胞网络。将钙黄绿素稀释在无血清培养基中，使其终浓度为 6–8 µg/ml。加入细胞染色液，使细胞完全浸没，室温下避光孵育 30-40 分钟。
2）用PBS清洗三次。注意PBS应缓慢加入上孔以避免影响细胞。使用Ex=485 nm，Em=529 nm波长进行荧光观察

图5. 血管免疫荧光染色

4.3 3D 细胞培养

与传统细胞培养不同，3D细胞培养重现了细胞的体内环境。即使是简单的球状模型也可以弥补单层培养的不足。这些结构可以形成氧气、营养物质、代谢物和可溶性信号的梯度，进而形成多样化的细胞群。3D细胞培养技术可以更好地模拟细胞在生物体内生存的自然环境，使细胞与生化和生理反应之间的相互作用更加逼真。在3D环境中，细胞对内源性和外源性刺激的反应更接近其体内反应。
Ceturegel™基底膜基质在3D细胞培养中的具体操作为：将Ceturegel™基底膜基质与调整浓度的单细胞HepG2悬浮液1：1轻轻混合，用预冷的枪头将50μl上述混合后的单细胞悬浮液加入到预冷的24孔板中，形成拱形细胞滴，放入37℃、5％CO2培养箱中培养，每天观察、拍照。

图 6. 3D 细胞培养结果

表1. 3D细胞培养Ceturegel™基底膜基质使用参考：

注：不同批次的Ceturegel™基底膜基质有一定的浓度差异，建议用量仅供参考

4.4 体内成瘤实验

以HepG2细胞裸鼠皮下成瘤实验为例，采用Ceturegel™基底膜基质与细胞悬液1:1稀释，接种于4-5周龄BALB/c-nu雌性小鼠皮下，实验流程如下：
♦ 准备对数生长、细胞密度约80-90%的HepG2细胞，收集细胞前一天晚上换新鲜培养基。
♦ 用胰酶消化细胞，待细胞变圆，不离开培养皿时，除去胰酶，加入无血清培养基制成细胞悬液，离心清洗一次，终浓度为5×10⁷ 细胞/毫升
♦ 在 4 ℃ 下将细胞悬浮液和 Ceturegel™ 基底膜基质按 1:1 的比例稀释，使其最终浓度为 5 × 10⁷ 细胞/毫升
♦ 左手抓住固定好的裸鼠，在裸鼠右肩处进行皮下注射，接种时针头插入皮下稍深，约1cm深，以减少注射后细胞悬液从针眼溢出。
接种量为200μL。（此过程尽量在半小时内完成，途中应将细胞悬液置于冰上，以减缓细胞凋亡，防止出现凝胶现象）。
♦ 将裸鼠放回笼中继续喂养，约1周至1个月即可见到肿瘤。根据实验设计,当肿瘤体积达到要求时对裸鼠实施安乐死,并拍照。

注：对照组为培养基与细胞的悬浮液，最终密度与基质胶测试组相同。

4.5 类器官培养

类器官是由干细胞分化而来的 3D 多细胞微小组织。器官的一些特性可以复制。类器官是多细胞的，具有高度的自组装性，因此比传统的 2D 培养物更能表现出复杂的体内细胞反应和相互作用。来自正常或患病组织的干细胞和/或器官祖细胞可以与 Ceturegel™ 基底膜基质或胶原蛋白混合。形成肾脏、甲状腺、肝脏、脑、肺、肠、前列腺和其他微器官。例如，对于进行基因筛选的研究人员来说，Ceturegel™ 基底膜基质基底可用作生物墨水，以便在 3D 生物打印中精确定位和嵌入活细胞/类器官。

图7. 类器官操作流程

小鼠小肠类器官构建

样品制备：剪颈处死小鼠，表面喷洒酒精消毒。无菌环境下切取近胃端3~15cm肠组织，用镊子小心去除肠道外面的肠系膜及脂肪，放入4 ℃预冷的含1%双抗的DPBS溶液中。

样品清洗：用注射器冲洗肠道2-3次，用手术剪将肠道小心剪开，肠腔朝上，用手术刀片轻轻刮掉肠腔表面的肠绒毛，待肠绒毛刮掉后（露出透明组织），将肠组织放入新的含有DPBS的培养皿中，重复2-3次。

样本初步处理：将洗净的小肠组织剪成2mm宽的小块，转移至新的50ml离心管中，用DPBS轻轻清洗3-5次，去除肠绒毛细胞及漂浮的脂肪组织。

样本消化：将清洗干净的小肠碎片加入10-15ml预冷的含有3-5mM EDTA的DPBS进行消化，4℃孵育约30min，其间每隔10min轻轻振摇离心管一次。

消化后，弃去EDTA消化液的上清液，用新的DPBS缓冲液轻轻冲洗组织2-3次，以去除剩余的EDTA。

将10-15ml预冷的含有0.1%BSA的DPBS加入小肠组织碎片中，反复吹打、重悬组织碎片，使凹陷与基底层分离，取少许悬液进行镜检，当见到大量凹陷状结构时停止吹打，将吹出的组织悬液用70%μM滤网过滤，收集通过滤网的组织悬液。

重复步骤5-6两次，1500rpm、4℃离心3min。

混合液的配制：Ceturegel™基质胶重悬凹槽组织沉淀，每10μL基质胶重悬液含有200~600个凹槽，重悬后将混合液置于冰上并尽快操作，避免基质胶形成凝胶。
注：基质胶的稀释比例≥50%，以保证Ceturegel™在培养过程中基质粘合结构的稳定性。

将混合好的悬浮液点于24孔板底部中央，左右每孔各30~50μL，避免悬浮液接触孔板侧壁。

将培养好的培养板放入37℃二氧化碳恒温培养箱中，孵育约30min，直至基质凝胶凝固。

等待Ceturegel™基质胶完全凝固后，沿壁缓慢加入配制的肠道器官培养基，每孔800μL。

将24孔板放入37℃二氧化碳培养箱中培养，每3天更换新鲜培养基，监测类器官的生长情况，一般小鼠小肠类器官在5-7天内形成。

图8 小鼠小肠样器官体外培养结果

5. 常见问题

1、所得基材颜色有差异（淡黄色至深红色）是什么原因？
对于含有酚红的Ceturegel™基底膜基质，主要是由于酚红与碳酸氢盐与CO相互作用引起的₂但用5% CO平衡后色差会降低₂. 冻融后，轻轻摇晃小瓶，使 Ceturegel™ 基底膜基质均匀分散。
2. Ceturegel™基底膜基质操作时应注意哪些事项？
所有操作应在无菌环境中进行，并使用预冷的移液器以确保 Ceturegel™ 基底膜基质均质化。
3. 如何冷冻和保存Ceturegel™基底膜基质以供使用？
冷冻和解冻后的 Ceturegel™ Matrix LDEV-Free Ceturegel™ 基底膜基质可以分装在多个小管中。所有分装都应分装在预冷的冷冻管中，并应快速冷冻和储存，以避免多次冷冻和解冻。所有相关物品在使用前都应预冷。使用预冷的移液器、吸头和小管来处理 Ceturegel™ 基底膜基质。

6. Ceturegel™基底膜基质的选择指南 Yeasen

不同类型的Ceturegel™基底膜基质有不同的应用，标准浓度的Ceturegel™基底膜基质可用于极性细胞培养，如上皮细胞，可促进多种细胞分化，用于肿瘤细胞迁移、侵袭实验。高浓度的Ceturegel™基底膜基质在体内应用广泛，可用于小管形成实验。低生长因子（GFR）主要作用是消除实验中生长因子的干扰，适用于对基底膜制备要求高的研究。不含酚红的Ceturegel™基底膜基质可消除酚红指示剂的干扰，适用于显色实验，如比色法、荧光检测等。人胚胎干细胞培养级Ceturegel™基底膜基质专门用于人胚胎干细胞培养、诱导多能无饲养层干细胞培养。 Yeasen 提供多种类型的Ceturegel™基底膜基质，您可以根据您的实验进行选择。

表 2. Ceturegel™基质选择指南

产品类型	货号	产品名称	Matrigel 货号	申请方向
基础浓度（8-12 mg/ml）	40183ES	Ceturegel™Matrix LDEV-Free	356234/ 354234	适应二维和三维培养、侵袭、迁移实验，也可用于体内致瘤实验
	40184ES	Ceturegel™Matrix不含酚红，不含LDEV	356237	主要用于荧光检测实验等颜色检测
生长因子减少	40185ES	Ceturegel™Matrix GFR，LDEV-Free	354230	主要排除生长因子对实验的干扰。适用于生长因子、信号通路等相关研究。
	40186ES	Ceturegel™Matrix GFR，不含酚红，不含LDEV	356231
高浓度（≥18mg/ml）	40187ES	Ceturegel™基质高浓度，不含LDEV	354248	主要用于血管生成、凝胶栓塞、体内肿瘤形成等实验（对于血管生成，建议Ceturegel™基底膜基质的终浓度≥10mg/ml）
	40189ES （询问）	Ceturegel™Matrix高浓度，GFR，无LDEV	354263
	40188ES	Ceturegel™Matrix 高浓度，不含酚红，不含LDEV	354262
对于干细胞	40190ES	Ceturegel™Matrix 符合 hESC 标准，不含 LDEV	354277	主要用于干细胞培养，如hESC、iPSC等。
类器官特异性	40191ES （询问）	Ceturegel™类器官培养基质，不含酚红，不含LDEV	356255	用于类器官培养的 Ceturegel™ 基底膜基质