1. Hvad er dendritiske celler (DC)?
Dendritiske celler (DC'er) er de mest effektive antigenpræsenterende celler (APC'er) i den menneskelige krop. DC'er er de eneste APC'er, der er i stand til robust at stimulere naiv T-celleproliferation. Andre typer APC (såsom monocytter, makrofager, B-celler osv.) kan kun stimulere aktiverede eller hukommelses-T-celler. Derfor er DC-celler initiatorerne af adaptive T-celle-immunresponser og spiller en ekstremt vigtig rolle i tumorimmunitet. DC-celler udtrykker i høj grad MHC-I- og MHC-II-molekyler på deres overflade og har specifikke overflademarkører. De optager, behandler og stimulerer T-celler til at aktivere antigener og bestemmer i sidste ende differentieringsretningen for T-celler.
2. Kilde til DC
DC-celler er til stede i meget små mængder i kroppen. Det tager lang tid at isolere DC direkte fra kroppen, og celleudbyttet er meget lavt, hvilket i høj grad begrænser forskningen og anvendelsen af DC. DC kan dog differentieres og induceres fra DC-precursorceller i forskellige væv, såsom precursorceller i knoglemarvsvæske, monocytter i perifert blod og navlestrengsblod.
For mennesker, da humant perifert blod er det mest bekvemme at opnå og har det største antal monocytter, er den mest almindeligt anvendte metode at inducere DC fra humane perifere mononukleære blodceller (PBMC). For mus er den mest almindelige metode at inducere DC fra knoglemarvsceller, nemlig knoglemarvs-afledte dendritiske celler (BMDC).
Figur 1. Skematisk diagram af den klassiske BMDC-fremstillingsmetode
3. BMDC-fremstillingsmetode
Almindelige metoder til at forberede muse-BMDC'er er:
3.1 Klassisk BMDC-dyrkningsmetode - Inaba-metoden (modificeret)
3.2 Storskala udarbejdelse af BMDC - Sons metode
3.3 Udarbejdelse af BMDC - Lutz metode i stor skala
3.1 [Klassisk BMDC-kulturmetode] - Inaba-metoden (forbedret)
【Baggrund】
en. Antallet af BMDC'er opnået ved Inaba-metoden er 5-7 x 106/mus;
b. Den originale Inaba-metode bruger kun GM-CSF til at inducere produktionen af BMDC'er. Selvom de opnåede BMDC'er har en stærk stimulerende evne i den blandede lymfocytreaktion, er modenheden af DC'er ikke så god som den for den kombinerede induktion af GM-CSF+IL-4. Derfor bruger den efterfølgende forbedrede metode ofte den kombinerede induktion af GM-CSF+IL-4.
【Dyrkningstrin】
3.1.1 Indhentning af museknoglemarvsceller
1) Mus (6-10 uger gamle) blev dræbt ved cervikal dislokation, alle lårben og skinneben blev fjernet kirurgisk, og muskelvævet omkring knoglerne blev fjernet så meget som muligt med saks og pincet.
[Note] Beskadig ikke knoglerne.
2) Flyt knoglen til den rene bænk og læg den i blød i en steril kulturskål indeholdende 70 % alkohol i 2-5 minutter for at desinficere og sterilisere, og vask den derefter to gange med steril PBS.
3) Flyt knoglen til en anden ny kulturskål indeholdende PBS, klip de to ender af knoglen med en saks, og brug derefter en sprøjte til at udtrække PBS. Stik nålen ind i knoglemarvshulen fra begge ender af knoglen, og skyl knoglemarven gentagne gange ind i kulturskålen, indtil knoglen bliver helt hvid.
4) Saml knoglemarvssuspensionen og filtrer små fragmenter og muskelvæv fra med et 200 mesh nylonnet.
5) Centrifuger filtratet ved 1200°C rpm for 5 min og kasser supernatanten.
6) Tilsæt 2 ml ammoniumchlorid lyseringsbuffer for røde blodlegemer (1x), resuspender cellerne og inkuber ved stuetemperatur i 3-5 min, op til 10 min.
7) Tilsæt 10 ml PBS for at neutralisere effekten af lyseringsbufferen, og centrifuger derefter ved 1200 rpm for 5 min og kasser supernatanten.
8) Vask én gang med PBS, og resuspender derefter cellerne i RPMI1640 kulturmedium indeholdende 10% FBS. Museknoglemarvsceller er blevet opnået.
Fremstilling af ammoniumchloridopløsning af røde blodlegemer:
en. Forbered 10x opbevaringsopløsning som følger: vej 82,9 g NH4Cl, 10,0 g KHCO3 og 0,37 g Na2EDTA, opløses i 1 L destilleret vand, filtreres med 0,22 μm filtermembran til sterilisering og opbevaring ved 4 ℃ i 6 måneder;
b. Før brug fortyndes 10x opbevaringsopløsning med sterilt destilleret vand 1:9 til 1x arbejdsopløsning.
[Note] Fordi ammoniumchloridopløsning af røde blodlegemer har en vis skadelig virkning på knoglemarvsceller, bør hæmolysetiden forkortes så meget som muligt.
3.1.2 Induktion af BMDC-differentiering
1) Tæl museknoglemarvscellerne opnået i trin 1 og juster cellekoncentrationen til 0,5-1×106/ml med RPMI 1640 komplet dyrkningsmedium indeholdende 10% FBS.
2) Plads i en 24-brønds kulturplade, 1 ml celler pr. brønd, tilsæt rekombinant muse-GM-CSF (20 ng/ml) og IL-4 (10 ng/ml), og kultur i en 37 ℃, 5 % CO2 inkubator. Dette er kulturens 0. dag.
【Note】
en. Generelt omkring 4-5x107 knoglemarvsceller kan høstes fra én mus, så mindst 40-50 brønde af en 24-brønds plade kan udplades.
b. Koncentrationsintervallerne for GM-CSF og IL-4 er 20-50 ng/ml og 10-40 ng/mlhhv.
3) Ryst forsigtigt dyrkningspladen hver 2. dag, og udskift derefter 3/4 af volumenet med frisk dyrkningsmedium og genopfyld cytokiner.
4) Mellem den 5. og 8. dag blæses forsigtigt dyrkningsmediet for at opsamle suspenderede celler og løst vedhæftede celler.
5) Centrifuger ved 1200 rpm for 5 min og kasser supernatanten.
6) Resuspender cellerne i RPMI 1640 komplet dyrkningsmedium indeholdende 10% FBS og tæl dem, juster derefter cellekoncentrationen til 1×106/ml, og tilsæt rekombinant muse-GM-CSF (20 ng/ml) og IL-4 (10 ng/ml).
7) Plad cellerne i 100 mm kulturskåle (op til 10 ml pr. skål) eller 6-brønds kulturplader (2m/brønd).
8) Fortsæt med at dyrke i en 37℃, 5% CO2 inkubator i 1-2 dage.
9) Saml de suspenderede celler, som er de mere modne BMDC'er.
【Note】
en. Trin 2.5-2.8 er re-pletteringstrin, hvis formål er at gøre BMDC opnået i trin 2.4 mere modent.
b. Inden for 3 timer efter genudpladning kan man se mange spiny adhærente celler migrere fra DC-klyngerne, og efter 1 dags dyrkning vil disse adhærente celler blive fundet at være løsnet fra bunden af dyrkningspladen, og mange typiske DC'er kan ses flyde i dyrkningsmediet.
3.1.3 Fuld modning af BMDC
[Bemærk] BMDC'erne opnået i trin 2 er ikke fuldt modne DC'er. Hvis du ønsker at opnå fuldt modne DC'er, skal du stadig induceres af LPS, CD40L eller TNF-a.
1) Centrifuger BMDC opnået i trin 2.4 eller 2.9 ved 1200 rpm for 5 min og kasser supernatanten.
2) Resuspender bundfaldet med RPMI komplet dyrkningsmedium indeholdende rekombinant muse-GM-CSF (20 ng/ml) og IL-4 (10 ng/ml), og juster cellekoncentrationen til 1×106/ml efter optælling.
3) Tilføj til 24-brønds kulturplader og tilføj modningsinducere såsom TNF-α (250 U/ml), LPS (1 μg/ml) eller CD40L (1 μg/ml).
4) Kultur i en 37℃, 5% CO2 inkubator i 2 dage.
5) Saml de suspenderede celler og celler, der vokser løst fastgjort til væggen, som er modne dendritiske celler.
3.2【BMDC masseproduktionsmetode】-Søn metode
【Baggrund】
en. Denne metode kan opnå 30-40×106 DC/mus inden for 7 dage, hvilket er 7-10 gange mere end Inaba klassiske metode. Efter DC er centrifugeret gennem 14,5% metrizamidgradient, kan renheden (dvs. CD11c+/I-Ab+ celler) nå 85-95%.
b. Endocytoseevnen af DC opnået ved denne metode er svagere end den af Inaba klassiske metode, men mængden af udskilt IL-12p70 er ens.
c. DC opnået ved denne metode har stærkere stimuleringsevne i blandet lymfocytreaktion end Inaba klassiske metode.
d. DC opnået ved denne metode kan inducere stærkere specifik T-cellerespons.
e. Sammenfattende kan Son-metoden opnå mere og mere moden BMDC end den klassiske metode.
【Dyrkningstrin】
3.2.1 Indhentning af museknoglemarvsceller
Se de tilsvarende trin i Inaba-metoden (modificeret).
3.2.2 Tilberedning af store mængder BMDC
1) Tæl museknoglemarvscellerne opnået i trin 1 og juster cellekoncentrationen til 2×105/ml med RPMI 1640 komplet dyrkningsmedium indeholdende 10% FBS.
2) Spredt i 6-brønds kulturplader, 5 ml celler pr. brønd, tilsæt rekombinant muse-GM-CSF (1000 U/ml) og IL-4 (1000 U/ml), og kultur i en 37 ℃, 5 % CO2 inkubator.
3) På den 4. dyrkningsdag suppleres dyrkningssystemet med rekombinant muse-GM-CSF (1000 U/ml) og IL-4 (1000 U/ml).
4) Saml DC'er på den 7. dyrkningsdag, resuspender med 2-4 ml RPMI 1640 komplet dyrkningsmedium, tilsæt til et lige så stort volumen på 14,5 % (w/v) mepanema, og centrifuger ved stuetemperatur i 20 min ved 1200xg.
5) Saml mellemlaget og vask det tre gange med RPMI 1640 komplet dyrkningsmedium til senere brug.
[Note] DC på dette tidspunkt er en umoden BMDC. Hvis du ønsker at modne det yderligere, skal du springe til trin 3.
3.2.3 Fuld løbetid af BMDC
1) Genudpladede BMDC'erne indsamlet i trin 2.4 og tilføjede rekombinant muse-GM-CSF (1000 U/ml) og IL-4 (1000 U/ml), samt LPS (1-10 μg/ml) til kultursystemet
2) Dyrket i en 37℃, 5% CO2 inkubator i 2 dage for at opnå modne BMDC'er.
3.3【BMDC masseforberedelsesmetode】-Lutz metode
【Baggrund】
en. Lutz-metoden ligner Son-metoden, og begge metoder kan fremstille BMDC i store mængder, men Lutz-metoden er mere udbredt end Son-metoden.
b. Denne metode kan opnå mere BMDC, op til 1-3 x 108 DC/mus, og renheden kan nå 90-95%;
c. Cytokinkoncentrationen brugt i denne metode er meget lavere end Son-metoden, kun 200 U/ml, og det falder til 30-100 U/ml fra den 8. til den 10. dyrkningsdag, hvilket i høj grad kan spare reagensomkostningerne;
d. Den største forskel på denne metode og Inaba classic-metoden og Son-metoden er, at knoglemarvscellerne dyrkes i en bakteriekulturskål (petriskål) i stedet for en cellekulturplade. Inaba forklarede, at bakteriekulturskålen ikke er let for makrofager i knoglemarven at klæbe til væggen, og derved hæmme udviklingen af makrofager og undgå makrofagernes hæmmende virkning på DC-modning. Dette kan være hovedårsagen til, at denne metode kan opnå et stort antal BMDC'er ved en lavere pletteringsdensitet.
e. Men dyrkningstiden for denne metode er relativt lang, og den kræver 10-12 dage. På den ene side er dette for at få flere BMDC'er. På den anden side er de fleste granulocytter og lymfocytter svære at overleve i så lang tid, så renheden af de endelig opnåede BMDC'er kan forbedres;
f. Denne metode bruger kun GM-CSF til induktionskultur, og de opnåede BMDC'er indeholder både umodne og modne DC'er. For yderligere at forbedre modenheden skal LPS eller TNF-α bruges i yderligere 1-2 dages induktion, og indholdet af modne DC-celler vil nå 50-70%.
【Dyrkningstrin】
3.3.1 Indhentning af museknoglemarvsceller
Se de tilsvarende trin i Inaba-metoden (modificeret), og bemærk, at hæmolysetrinnet skal udelades.
3.3.2 Storstilet udarbejdelse af BMDC
1) Tæl museknoglemarvscellerne opnået i trin 1 og juster cellekoncentrationen til 2×105/ml med RPMI 1640 komplet dyrkningsmedium indeholdende 10% FBS;
2) Fordel i 100 mm bakteriekulturskåle (Petriskål), 10 ml celler pr. skål, og tilsæt rekombinant muse-GM-CSF (200 U/ml), og dyrkning ved 37 ℃, 5 % CO2 inkubator;
[Note] Her bruges bakteriekulturskåle, ikke cellekulturplader.
3) På den 3. dag tilsættes 10 ml komplet dyrkningsmedium indeholdende 20 ng/ml rekombinant muse-GM-CSF til dyrkningsskålen;
4) På den 6. og 8. dag skal du udskifte halvdelen af mediet, dvs. samle det gamle dyrkningsmedium, resuspendere cellepelleten med komplet dyrkningsmedium indeholdende 20 ng/ml rekombinant muse-GM-CSF efter centrifugering, og anbring derefter cellesuspensionen tilbage i den originale skål;
5) På den 10. dag kan cellerne indsamles, som er BMDC'er.
3.3.3 Fuld modning af BMDC'er
1) Saml de suspenderede celler ved forsigtigt at blæse DC'erne på den 10. dyrkningsdag med en pipette, og centrifuger ved 300xg i 5 minutter ved stuetemperatur;
2) Kassér supernatanten, resuspender cellepelleten med 10 ml RPMI 1640 komplet dyrkningsmedium, og spred det derefter på en 100 mm cellekulturplade;
3) Tilføj rekombinant muse-GM-CSF (100 U/ml) og TNF-a (500 U/ml) eller rekombinant muse-GM-CSF (100 U/ml) og LPS (1 μg/ml);
4) Fortsæt med at dyrke i en 37℃, 5% CO2 inkubator i 1-2 dage.
4. Identifikation af BMDC'er
l Morfologisk observation: De fleste BMDC'er vokser i kolonier, og cellerne har flere dendritiske fremspring, som er mere tydelige i modne BMDC'er.
l Cellefænotypeanalyse: Flowcytometri blev brugt til at detektere ekspressionen af CD11c, CD40, CD80, CD86, MHC klasse II-molekyler (IA/IE) på overfladen af DC-celler. BMDC'er udtrykker i høj grad disse molekyler, og ekspressionen af disse molekyler i fuldt modne BMDC'er vil blive yderligere øget.
l Blandet lymfocytreaktion (MLR): BMDC'er har en stærk stimulerende evne, og jo højere modenhed, jo stærkere er den stimulerende evne.
5. Hvordan vælger man en modningsinducer?
LPS, CD40L og TNF-α er almindeligt anvendte og effektive modningsinducere til både human DC og mus DC. TNF-a har den svageste evne til at inducere DC-modning blandt de tre. LPS og CD40L er begge stærke inducere til DC fuld modning in vitro. Modningen af DC induceret af begge er ens, men det inducerede cytokinspektrum er forskelligt. CD40L-induceret moden BMDC viser den stærkeste immunregulerende evne in vivo, herunder generering af beskyttende og terapeutiske tumorimmunresponser. Koncentrationen, der bruges til at stimulere DC fuld modning med LPS, er generelt 1-10 μg/mL, men faktisk har 0,1 μg/mL en meget stærk effekt, men til forsikringsformål er 1 μg/mL anvendes generelt. Det skal bemærkes, at CD40L-molekyler tilhører TNF-ligandfamilien, som er kendetegnet ved, at de kun kan fungere efter dannelse af trimerer. Derfor er det bedst at bruge rekombinant CD40L trimer protein til at stimulere DC, hvilket vil have en god effekt. Hvis CD40L-monomerer bruges til at stimulere DC, er modenheden i de fleste tilfælde ikke særlig høj.
6. Valg af træningsmetode
Tabel 1.Sammenligning af tre almindelige eksperimentelle metoder til fremstilling af BMDC
| Parameter | Klassisk BMDC kulturmetode - Inaba metode | Storstilet udarbejdelse af BMDC - Son metode | Storskala udarbejdelse af BMDC - Lutz metode |
| Antal citater i PubMed | 783 | 24 | 663 |
| Knoglemarvshæmolyse, lyse af røde blodlegemer | JA | JA | Ingen |
| Knoglemarv fjerner først lymfocytter | JA | Ingen | Ingen |
| Fjernelse af granulocytter under dyrkning | JA | Ingen | Ingen |
| Indledende udpladevolumen af knoglemarvsceller | 1 ml | 15 ml | 10 ml |
| Inkubator | 24-brønds cellekulturplader | 6-brønds cellekulturplade | 100 mm bakteriekulturskål |
| Kulturmedium | RPMI 1640+10% FCS | ||
| Koncentration af mus GM-CSF | 200-1000 U/ml | Den tilsatte initiale koncentration er 125-1000 U/ml På den 4. og 7. dag tilsættes tilstrækkelige mængder GM-CSF og IL-4 til dyrkningssystemet. | Den initiale tilsatte koncentration er 200 U/ml.3-100 U/ml efter den 10. dag |
| Mus IL-4 | Behøver ikke | Behov，Koncentrationen er den samme som GM-CSF | Behøver ikke |
| Væskeudvekslingsmetode | På 2. og 4. dag kasseres 50%-75% af det gamle dyrkningsmedium (som indeholder celler) og erstattes med frisk komplet dyrkningsmedium indeholdende tilstrækkeligt med GM-CSF. | / | På den 3. dag blev et lige så stort volumen komplet dyrkningsmedium indeholdende GM-CSF tilsat. På den 6., 8. og 10. dag blev halvdelen af mediet udskiftet. Det gamle dyrkningsmedium (indeholdende celler) blev aspireret, centrifugeret, resuspenderet i frisk komplet dyrkningsmedium indeholdende GM-CSF og derefter sat tilbage. |
| Kulturtid før passage (udvidelse) | 6 dage | 7 dage | 10 dage |
| Kulturtid efter passage (modning) | 2 dage | Ingen | 1-2 dage |
| Fuld modenhedsinducer | TNF-ɑ(250 U/ml） | LPS(1-10 μg/ml) | TNF-ɑ(250 U/ml）eller LPS(1 μg/ml) |
| Tidspunkt for DC-cellehøst | 7-8 dage | 7-8 dage | 10-13 dage |
| DC Renhed | Dag 8:60-70 % | Dag 7:85-95 % | Dag 10-12:80-90 % |
| DC produktion/mus | (5-7)×106 | (3-4)×107 | (1-3)×108 |
7. Anbefalede DC-kulturreagenser
| Produktnavn | Kat | Størrelse |
| 91108ES | 5 μg/50 μg/100 μg/500 μg | |
| 90144ES | 5 μg/50 μg/100 μg/500 μg | |
| 90621ES | 5 μg/20 μg/50 μg/500 μg | |
| 94016ES | 25 μg/100 μg/500 μg |