1. Forord
Makrofager er store fagocytter, der er differentieret fra monocytter i blodet. De er til stede i næsten alle væv, især dem, der er i hyppig kontakt med omverdenen såsom hud, lunger og tarme. Makrofager spiller en afgørende rolle i mange biologiske processer, såsom humant immunforsvar, inflammatorisk respons, vævsreparation, immunregulering og sygdomsudvikling.
Primære humane makrofager er vanskelige at isolere fra væv i tilstrækkeligt antal og prolifererer ikke i kultur. Monocyt-afledte makrofager giver et glimrende alternativ, fordi monocytter i humant blod let opnås i store mængder og kan differentieres til makrofager in vitro.
2. Biologiske funktioner af makrofager
- Fagocytose
Makrofager genkender og opsluger patogener og døde cellerester gennem receptorer på deres overflade. Denne proces hjælper ikke kun med at fjerne infektion, men forhindrer også disse stoffer i at akkumulere i kroppen, hvilket kan forårsage betændelse eller andre problemer.
- Anti-patogen forsvar
Makrofager bekæmper patogener ved at producere kemikalier, der dræber mikroorganismer, såsom reaktivt oxygen og nitrogenoxider, samt cytokiner og kemokiner, der regulerer inflammatoriske reaktioner.
- Inflammationsregulering
Makrofager spiller en kompleks rolle i inflammatoriske reaktioner. De kan ikke kun fremme inflammation ved at frigive pro-inflammatoriske cytokiner såsom tumornekrosefaktor alfa (TNF-α) og interleukin 1 (IL-1), men også hæmme inflammation ved at producere antiinflammatoriske cytokiner såsom IL-10 og TGF-β.
- Vævsreparation og rekonstruktion
Efter en inflammatorisk reaktion hjælper makrofager med at reparere og regenerere væv ved at udskille forskellige vækstfaktorer. De fjerner resterne af skader, mens de fremmer dannelsen af nyt væv.
- Immunmodulering
Makrofager fremmer specifikke immunresponser ved at præsentere antigener til T-celler. Samtidig regulerer de andre komponenter i immunsystemet ved at udskille forskellige cytokiner, såsom at regulere aktiviteten af T-celler og B-celler.
- Forholdet til sygdomme
Makrofager spiller en vigtig rolle i udviklingen af mange sygdomme, herunder infektionssygdomme, autoimmune sygdomme, tumorer og kroniske inflammatoriske sygdomme som aterosklerose.
3. Klassificering af makrofager
I henhold til deres aktiveringstilstand og funktion kan makrofager opdeles i to hovedkategorier: M1 og M2. Disse to undertyper spiller forskellige roller i immunrespons og inflammationsregulering.
M1 makrofager
M1-makrofager stimuleres hovedsageligt af cytokiner såsom interferon gamma (IFN-y) og tumornekrosefaktor alfa (TNF-α) og har pro-inflammatoriske egenskaber. De har stærk antimikrobiel aktivitet, kan producere iltfrie radikaler og inflammatoriske faktorer og deltager i at dræbe og fjerne patogene mikroorganismer som bakterier og vira.
M1-makrofager deltager i kroppens immunforsvar og inflammatoriske respons, fremmer infiltrationen af inflammatoriske og immunceller, hjælper med at rense inficerede og beskadigede væv og fremmer forekomsten og vedligeholdelsen af immuninflammatoriske reaktioner.
M2 makrofager
M2-makrofager stimuleres hovedsageligt af cytokiner såsom interleukin-4 (IL-4) og interleukin-13 (IL-13) og har anti-inflammatoriske og reparerende egenskaber. De deltager i vævsreparations- og regenereringsprocesser, fremmer antiinflammatoriske reaktioner og immunregulering.
M2-makrofager spiller en vigtig rolle i det sene stadium af inflammation og vævsreparation, fremmer opløsningen af inflammation og vævsreparation, regulerer balancen mellem immunresponser og fremmer vævsregenerering og -reparation.
Figur 1. Sammenfatning af de vigtigste makrofagpolarisationstilstande for aktiverede makrofager [1]
4. Isolering, dyrkning og differentiering af makrofager in vitro
4.1 Adskillelsesmetode
- Isolation fra perifert blod
Isolering af monocytter: Mononukleære celler fra perifert blod (PBMC'er) isoleres ved hjælp af tæthedsgradientcentrifugering (f.eks. Ficoll-Paque). Blodprøven tilsættes det øverste lag af Ficoll, og efter centrifugering er monocytterne placeret mellem plasma- og Ficoll-lagene.
Isolering af makrofager: Efter at monocytterne er isoleret fra PBMC'er, kan de mononukleære precursorceller isoleres yderligere ved plastisk adhæsion. Monocytter dyrkes i plastikkulturskåle i flere timer, ikke-adhærente celler fjernes, og de resterende adhærente celler er hovedsageligt mononukleære precursorceller.
- Isolation fra væv
Vævsprøver nedbrydes til enkeltcellesuspensioner ved mekanisk og/eller enzymatisk behandling (f.eks. collagenase og DNase). Ikke-målceller fjernes ved densitetsgradientcentrifugering eller negativ selektion (ved anvendelse af antistoffer og magnetiske perler), og makrofager opsamles.
4.2 Kulturmetode
Almindeligt anvendte dyrkningsmedier omfatter RPMI 1640 eller IMDM, som normalt skal suppleres med 10 % føtalt bovint serum (FBS), 1 % penicillin/streptomycin og nødvendige vækstfaktorer. Dyrkningsbetingelser er normalt i en inkubator ved 37°C og 5% CO2
4.3 Differentieringsinduktionsmetode
- Differentiering fra mononukleære precursorceller
Brug af M-CSF: Tilføj makrofagkolonistimulerende faktor (M-CSF) til dyrkningsmediet, sædvanligvis i en koncentration på 20-50 ng/ml, og fortsæt dyrkningen i 7-10 dage for at inducere differentieringen af mononukleære precursorceller til makrofager.
Brug af GM-CSF: Granulocyt-makrofag kolonistimulerende faktor (GM-CSF) kan også inducere differentieringen af makrofager, især tendensen til at producere M1 (pro-inflammatoriske) makrofager.
- Yderligere regulering af fænotype og funktion
M1 makrofager: kan induceres ved at tilsætte IFN-y (interferon-y) og LPS (lipopolysaccharid) til dyrkningsmediet.
M2 makrofager: kan induceres ved at tilføje antiinflammatoriske cytokiner såsom IL-4 og IL-13.
Disse metoder giver forskere mulighed for at studere makrofagernes forskellige biologiske funktioner og deres adfærd under patologiske forhold in vitro. De specifikke driftsbetingelser for hvert trin (såsom celletæthed, dyrkningstid, koncentration af tilsatte faktorer osv.) skal muligvis optimeres i henhold til eksperimentets specifikke formål.
Tabel 1.Makrofagerkultur og induktionsbetingelser
| Cellekilde | Kulturmedium | Indledende tilføjelser | M1 polarisering | M2 polarisering |
| THP-1 celle | RPMI 1640 | 100 ng/ml PMA | 20 ng/ml IFN-y 100 ng/ml LPS | 20 ng/ml IL-4 20 ng/ml IL-13 |
| Monocytter | RPMI 1640 | M1:50 ng/ml GM-CSF M2: 50 ng/ml M-CSF | 10 ng/ml LPS 50 ng/ml IFN-y | M2a: 20 ng/ml IL-4 M2b: IgG+LPS M2c: 20 ng/ml TGF-β1 eller 10 ng/ml IL-10 |
| Mpil | IMDM | 10-50 ng/ml M-CSF | 100 ng/ml LPS (50ng/mL IFN-y kan tilsættes) | 10 ng/ml IL-4 (10 ng/ml IL-13 kan tilsættes) |
| RAW264.7 Celle | DMEM | / | 100 ng/ml LPS | 20 ng/ml IL-4 (20 ng/ml IL-10 kan tilsættes） |
5. Analysedata
YEASEN leverer en række HiActive® højaktive cytokinprodukter relateret til makrofagkultur for at understøtte makrofagforskning.
HiActive® højaktive cytokiner:Den biologiske aktivitet af hvert cytokin er blevet verificeret for at sikre den høje aktivitet af cytokinet.
Aktivitetsbekræftelsesdata:
Rekombinant muse M-CSF protein
Figur 1. Målt i et celleproliferationsassay ved hjælp af M-NFS-60 mus myelogen leukæmi lymfoblastceller. ED50 for denne effekt er typisk 16,74 -25,83 ng/ml.
Rekombinant Mus GM-CSF Protein
Figur 2. ED50 som bestemt ved et celleproliferationsassay under anvendelse af murine FDC-P1-celler er 2,79-12,84 pg/ml.
Rekombinant Human IL-10 Protein
Figur 3. ED50 som bestemt ved et celleproliferationsassay under anvendelse af murine MC/9-celler er mindre end 0,1 ng/ml, svarende til en specifik aktivitet på > 1,0×107 IE/mg.
Relaterede produkter
| Klassifikation | Arter | Kat | Specifikation |
| G-CSF | Human | 2 μg/10 μg/ 50 μg/ 100 μg | |
| Mus | 2 μg/ 10 μg/50 μg/100 μg/500 μg | ||
|
M-CSF | Human | 10 μg/100 μg/500 μg | |
| Mus | 10 μg/100 μg/ 500 μg | ||
|
GM-CSF | Human | 5 μg/50 μg/100 μg/ 500 μg | |
| Mus | 10 μg/100 μg/ 500 μg | ||
| IFN-y | Human | 20 μg/50 μg/ 100 μg/ 500 μg | |
| Mus | 5 μg/50 μg/ 100 μg/ 500 μg | ||
| IL-4 | Human | 5 μg/50 μg/ 100 μg/ 500 μg | |
| Mus | 5 μg/ 100 μg/ 500 μg | ||
| IL-10 | Human | 2 μg/ 10 μg/ 50 μg/ 100 μg/ 500 μg | |
| Mus | 2 μg/ 10 μg/ 50 μg/ 100 μg/ 500 μg | ||
| IL-13 | Human | 2 μg/ 10 μg/ 50 μg/ 100 μg/ 500 μg | |
| Mus | 2 μg/ 10 μg/ 50 μg/ 100 μg/ 500 μg |
Referencer
[1]Atri C, Guerfali FZ, Laouini D.Rolle af human makrofagpolarisering i inflammation under infektionssygdomme. Int J Mol Sci. 2018 Jun 19;19(6):1801.