Beskrivelse
T7 High Yield RNA Synthesis Kit optimerer transkriptionsreaktionssystemet. Sættet kan syntetisere det enkeltstrengede RNA effektivt ved at bruge T7 RNA-polymerase, det lineære dobbeltstrengede DNA med T7-promotorsekvensen som template, NTP'er som substrat til at kontrollere DNA-sekvensen nedstrøms for promotoren. Under transkription kan modificerede nukleotider tilføjes til substratet for at fremstille biotin eller farvestof-mærket RNA.
Dette kit kan syntetisere lange transkripter og korte transkripter, RNA kan produceres 100-200 μg med 1 μg DNA skabelon input. RNA'et syntetiseret ved transkription kan bruges til forskellige downstream-applikationer, såsom RNA-struktur- og funktionsforskning, RNase-beskyttelse, probehybridisering, RNAi, mikroinjektion og in vitro oversættelse.
Figur 1: In vitro RNA-transkriptionsproces
Feature
- Op til 180 μg RNA pr. reaktion fra 1 μg af kontrolskabelonen
- Optimeret reaktionssystem til IVT-processen
- Reducer dsRNA-produktionen
- Højere RNA-integritet og renhed
Anvendelse
- In vitro RNA syntese
Komponenter
| Komponenter nr. | Navn | 10623ES50 (50 T) | 10623ES60 (100 T) | 10623ES70 (500 T) |
| 10623-A | T7 RNA polymerase blanding | 100 μL | 200 μL | 1 ml |
| 10623-B | 10×transskriptionsbuffer | 100 μL | 200 μL | 1 ml |
| 10623-C | ATP (100mM) | 100 μL | 200 μL | 1 ml |
| 10623-D | CTP (100 mm) | 100 μL | 200 μL | 1 ml |
| 10623-E | GTP (100 mm) | 100 μL | 200 μL | 1 ml |
| 10623-F | UTP (100 mm) | 100 μL | 200 μL | 1 ml |
| 10623-G | Kontrol DNA skabelon (500ng/μL) | 10 μL | 20 μL | 100 μL |
Forsendelse og opbevaring
Tøris transport. Opbevares ved -15℃ ~ -25℃, gyldig i to år.
Figurer
Figur 1. Standard-RNA blev syntetiseret in vitro under anvendelse af T7 RNA-syntesesæt.
Reaktionen blev inkuberet i et PCR-instrument ved 37°C i 2 timer og derefter oprenset med magnetiske perler (kat #12602). Udbytteresultatet blev analyseret med NanoDrop spektrofotometer som vist i figur 1.
Figurer 2. Transskriptionsdemonstrationen af forskellige længder af RNA ved hjælp af T7-kit i henholdsvis elektroforetogrammet (figur 2A), kapillærelektroforesediagrammet (figur 2B) og kromatogrammet (figur 2C)
Figur 3. Syntese af capped RNA in vitro.
Reaktionen blev inkuberet i PCR-instrument ved 37 ℃ i 2 timer og derefter oprenset med magnetiske perler (kat #12602). Udbytteresultatet blev analyseret med NanoDrop spektrofotometer som vist i figur 3A. Integritetsresultatet blev analyseret ved kapillarelektroforese som vist i figur 3B.
1. Lavt afskriftsudbytte
Kvaliteten af skabelonen er tæt forbundet med udbyttet. Hvis udbyttet af forsøgsgruppen er væsentligt lavere end kontrolgruppen, er de mulige årsager:
① den eksperimentelle skabelon indeholder hæmmende komponenter;
② Skabelonen har noget galt.
Forslag:
① Rens skabelonen igen;
② Bestem skabelonkvantificeringen og dens integritet;
③ Forlæng reaktionstiden;
④ Øg mængden af skabeloninput;
⑤ Prøv andre promotorer og RNA-polymeraser.
2. Lavt udbytte af korte afskrifter
Et kort transkriptionsinitieringsfragment vil hæmme reaktionen. Når transkriptionsproduktet er mindre end 100 nt, vil forlængelse af reaktionstiden til 4-8 timer eller øge mængden af skabelon til 2 μg øge RNA-udbyttet.
3. RNA-transkriptionslængden er større end forventet
Hvis elektroforesen viser, at produktbåndet er større end den forventede størrelse, er de mulige årsager:
① Plasmidskabelonen er muligvis ikke fuldstændig lineariseret;
②3'-enden af sense-strengen har en fremtrædende struktur;
③ RNA'et har en sekundær struktur, der ikke er fuldstændig denatureret.
Forslag:
①Tjek om skabelonen er fuldstændig lineariseret, og udfør om nødvendigt yderligere linearisering;
②Vælg et passende restriktionsenzym for at undgå 3'-overhæng, eller brug Klenow Fragment/T4 DNA-polymerase til at fuldføre transkriptionen, før du fortsætter;
③Brug denatureret gel til at detektere RNA-produkter.
4. RNA-transkriptionslængden er mindre end forventet
Hvis elektroforesen viser, at produktbåndet er mindre end den forventede størrelse, er de mulige årsager:
①Skabelonen indeholder en termineringssekvens svarende til T7 RNA-polymerase;
②GC-indholdet i skabelonen er højt.
Forslag:
①Sænk reaktionstemperaturen (for eksempel 30°C). Nogle gange kan en sænkning af temperaturen øge transskriptionslængden, men det vil reducere udbyttet. Eller prøv forskellige RNA-polymeraser til transkription;
②Hvis skabelonens GC-indhold er højt, skal du bruge 42℃ til transskription, eller tilføj SSB for at øge udbyttet og transskriptionslængden.
5. Elektroforese-tailing af transkriptionsprodukter
Der er et halefænomen under elektroforese.
Mulige årsager:
① Kontamineret med RNase under eksperimentel drift;
② Kontamineret DNA skabelon af RNase.
Forslag:
①Brug RNase-fri pipettespidser og EP-rør, brug latex-engangshandsker og -masker, og alle reagenser er forberedt med RNase-fri H2O.
②Genrens skabelon-DNA'et.
[1] Dong Z, Zheng N, Hu C, et al.Nosema bombycis mikroRNA-lignende RNA 8 (Nb-milR8) øger svampepatogenicitet ved at modulere BmPEX16-genekspression i dens vært, Bombyx mori. Microbiol Spectr. 2021;9(2):e0104821. doi:10.1128/Spectrum.01048-21(IF:7.171)
[2] Wang X, Tang S, Ye S, et al. Ultrafølsom kvantificering af cirkulerende miR-195-5p med triple-streng displacement amplification kaskade. Talanta. 2022;242:123300. doi:10.1016/j.talanta.2022.123300(IF:6.057)
Betaling og sikkerhed
Dine betalingsoplysninger behandles sikkert. Vi gemmer ikke kreditkortoplysninger og har heller ikke adgang til dine kreditkortoplysninger.
Forespørgsel
Du kan også lide
FAQ
Produktet er kun til forskningsformål og er ikke beregnet til terapeutisk eller diagnostisk brug hos mennesker eller dyr. Produkter og indhold er beskyttet af patenter, varemærker og ophavsrettigheder ejet af Yeasen Biotechnology. Varemærkesymboler angiver oprindelseslandet, ikke nødvendigvis registrering i alle regioner.
Visse applikationer kan kræve yderligere tredjeparts intellektuelle ejendomsrettigheder.
Yeasen er dedikeret til etisk videnskab og mener, at vores forskning bør adressere kritiske spørgsmål og samtidig sikre sikkerhed og etiske standarder.