1. پیشگفتار

ماکروفاژها فاگوسیت های بزرگی هستند که از مونوسیت ها در خون متمایز می شوند. آنها تقریباً در تمام بافت ها وجود دارند، به ویژه بافت هایی که در تماس مکرر با دنیای خارج هستند مانند پوست، ریه ها و روده ها. ماکروفاژها در بسیاری از فرآیندهای بیولوژیکی مانند دفاع ایمنی انسان، پاسخ التهابی، ترمیم بافت، تنظیم ایمنی و توسعه بیماری نقش حیاتی دارند.

ماکروفاژهای اولیه انسانی به سختی از بافت ها جدا می شوند و در کشت تکثیر نمی شوند. ماکروفاژهای مشتق شده از مونوسیت یک جایگزین عالی ارائه می دهند زیرا مونوسیت ها در خون انسان به راحتی در مقادیر زیاد به دست می آیند و می توانند در شرایط آزمایشگاهی به ماکروفاژها تمایز یابند.

2. عملکردهای بیولوژیکی ماکروفاژها

• فاگوسیتوز

ماکروفاژها پاتوژن‌ها و بقایای سلول‌های مرده را از طریق گیرنده‌های روی سطح خود شناسایی کرده و می‌بلعند. این فرآیند نه تنها به رفع عفونت کمک می کند، بلکه از تجمع این مواد در بدن جلوگیری می کند که می تواند باعث التهاب یا مشکلات دیگر شود.

• دفاع ضد پاتوژن

ماکروفاژها با تولید مواد شیمیایی که میکروارگانیسم‌ها را از بین می‌برند، مانند اکسیژن فعال و اکسیدهای نیتروژن، و همچنین سیتوکین‌ها و کموکاین‌ها که پاسخ‌های التهابی را تنظیم می‌کنند، با پاتوژن‌ها مبارزه می‌کنند.

• تنظیم التهاب

ماکروفاژها نقش پیچیده ای در پاسخ های التهابی دارند. آنها نه تنها می توانند التهاب را با آزادسازی سایتوکاین های پیش التهابی مانند فاکتور نکروز تومور آلفا (TNF-α) و اینترلوکین 1 (IL-1) ترویج کنند، بلکه با تولید سایتوکاین های ضد التهابی مانند IL-10 و TGF-β، التهاب را مهار می کنند.

• ترمیم و بازسازی بافت

پس از یک پاسخ التهابی، ماکروفاژها با ترشح عوامل رشد مختلف به ترمیم و بازسازی بافت ها کمک می کنند. آنها بقایای آسیب را پاک می کنند و در عین حال باعث تشکیل بافت های جدید می شوند.

• تعدیل ایمنی

ماکروفاژها با ارائه آنتی ژن به سلول های T، پاسخ های ایمنی خاصی را تقویت می کنند. در عین حال، با ترشح سیتوکین های مختلف، مانند تنظیم فعالیت سلول های T و B، سایر اجزای سیستم ایمنی را تنظیم می کنند.

• ارتباط با بیماری ها

ماکروفاژها نقش مهمی در ایجاد بسیاری از بیماری ها از جمله بیماری های عفونی، بیماری های خود ایمنی، تومورها و بیماری های التهابی مزمن مانند آترواسکلروز دارند.

3. طبقه بندی ماکروفاژها

ماکروفاژها با توجه به وضعیت فعال شدن و عملکردشان به دو دسته اصلی M1 و M2 تقسیم می شوند. این دو زیرگروه نقش متفاوتی در پاسخ ایمنی و تنظیم التهاب دارند.

ماکروفاژهای M1

ماکروفاژهای M1 عمدتا توسط سیتوکین هایی مانند اینترفرون گاما (IFN-γ) و فاکتور نکروز تومور آلفا (TNF-α) تحریک می شوند و دارای ویژگی های پیش التهابی هستند. آنها فعالیت ضد میکروبی قوی دارند، می توانند رادیکال های آزاد اکسیژن و عوامل التهابی تولید کنند و در کشتن و پاکسازی میکروارگانیسم های بیماری زا مانند باکتری ها و ویروس ها شرکت کنند.

ماکروفاژهای M1 در دفاع ایمنی و پاسخ التهابی بدن شرکت می‌کنند، نفوذ سلول‌های التهابی و ایمنی را تقویت می‌کنند، به پاکسازی بافت‌های عفونی و آسیب‌دیده کمک می‌کنند و باعث بروز و حفظ پاسخ‌های التهابی ایمنی می‌شوند.

ماکروفاژهای M2

ماکروفاژهای M2 عمدتا توسط سیتوکین هایی مانند اینترلوکین-4 (IL-4) و اینترلوکین-13 (IL-13) تحریک می شوند و دارای ویژگی های ضد التهابی و ترمیم کننده هستند. آنها در فرآیندهای ترمیم و بازسازی بافت شرکت می کنند، پاسخ های ضد التهابی و تنظیم ایمنی را تقویت می کنند.

ماکروفاژهای M2 نقش مهمی در مرحله پایانی التهاب و ترمیم بافت دارند، رفع التهاب و ترمیم بافت را بهبود می‌بخشند، تعادل پاسخ‌های ایمنی را تنظیم می‌کنند و بازسازی و ترمیم بافت را تقویت می‌کنند.

شکل 1. خلاصه ای از حالت های پلاریزاسیون ماکروفاژهای اصلی ماکروفاژهای فعال شده ^[1]

4. جداسازی، کشت و تمایز ماکروفاژها در شرایط آزمایشگاهی

4.1 روش جداسازی

• جداسازی از خون محیطی

جداسازی مونوسیت ها: سلول های تک هسته ای خون محیطی (PBMCs) با استفاده از سانتریفیوژ با گرادیان چگالی (به عنوان مثال، Ficoll-Paque) جدا می شوند. نمونه خون به لایه بالایی فیکول اضافه می شود و پس از سانتریفیوژ، مونوسیت ها بین لایه های پلاسما و فیکول قرار می گیرند.

جداسازی ماکروفاژها: پس از جداسازی مونوسیت ها از PBMC ها، سلول های پیش ساز تک هسته ای را می توان بیشتر با چسبندگی پلاستیک جدا کرد. مونوسیت ها در ظروف کشت پلاستیکی برای چند ساعت کشت داده می شوند، سلول های غیر چسبنده حذف می شوند و سلول های چسبنده باقی مانده عمدتاً سلول های پیش ساز تک هسته ای هستند.

• جداسازی از بافت ها

نمونه‌های بافت با درمان مکانیکی و/یا آنزیمی (مانند کلاژناز و DNase) به سوسپانسیون‌های تک سلولی تجزیه می‌شوند. سلول های غیر هدف با سانتریفیوژ با گرادیان چگالی یا انتخاب منفی (با استفاده از آنتی بادی ها و دانه های مغناطیسی) حذف می شوند و ماکروفاژها جمع آوری می شوند.

4.2 روش کشت

محیط های کشت متداول شامل RPMI 1640 یا IMDM است که معمولاً باید با 10% سرم جنین گاوی (FBS)، 1% پنی سیلین/استرپتومایسین و فاکتورهای رشد لازم تکمیل شود. شرایط کشت معمولاً در انکوباتور در دمای 37 درجه سانتی گراد و 5 درصد CO2 است

4.3 روش القای تمایز

• تمایز از سلول های پیش ساز تک هسته ای

استفاده از M-CSF: فاکتور محرک کلنی ماکروفاژها (M-CSF) را معمولاً در غلظت 50-20 نانوگرم در میلی لیتر به محیط کشت اضافه کنید و کشت را برای 10-7 روز ادامه دهید تا تمایز سلول های پیش ساز تک هسته ای به ماکروفاژها را القا کند.

استفاده از GM-CSF: فاکتور تحریک کننده کلنی گرانولوسیت-ماکروفاژ (GM-CSF) همچنین می تواند باعث تمایز ماکروفاژها، به ویژه تمایل به تولید ماکروفاژهای M1 (پیش التهابی) شود.

• تنظیم بیشتر فنوتیپ و عملکرد

ماکروفاژهای M1: می توان با افزودن IFN-γ (اینترفرون-γ) و LPS (لیپوپلی ساکارید) به محیط کشت القا کرد.

ماکروفاژهای M2: را می توان با افزودن سایتوکین های ضد التهابی مانند IL-4 و IL-13 القا کرد.

این روش ها به محققان اجازه می دهد تا عملکردهای بیولوژیکی مختلف ماکروفاژها و رفتار آنها را تحت شرایط پاتولوژیک در شرایط آزمایشگاهی مطالعه کنند. شرایط عملیاتی خاص هر مرحله (مانند تراکم سلول، زمان کشت، غلظت فاکتورهای اضافه شده و غیره) ممکن است با توجه به هدف خاص آزمایش نیاز به بهینه سازی داشته باشد.

جدول 1.شرایط کشت ماکروفاژ و القاء

منبع سلولی	محیط کشت	اضافات اولیه	قطبش M1	قطبش M2
THP-1Cell	RPMI 1640	100 نانوگرم در میلی لیتر PMA	20 نانوگرم در میلی لیتر IFN-γ 100 نانوگرم در میلی لیتر LPS	20 نانوگرم در میلی لیتر IL-4 20 نانوگرم در میلی لیتر IL-13
مونوسیت ها	RPMI 1640	M1: 50 نانوگرم در میلی لیتر GM-CSF M2: 50 نانوگرم در میلی لیتر M-CSF	10 نانوگرم در میلی لیتر LPS 50 نانوگرم در میلی لیتر IFN-γ	M2a: 20 نانوگرم در میلی لیتر IL-4 M2b: IgG+LPS M2c: 20 نانوگرم در میلی لیتر TGF-β1 یا 10 نانوگرم در میلی لیتر IL-10
مفلش	IMDM	10-50 نانوگرم در میلی لیتر M-CSF	100 نانوگرم در میلی لیتر LPS (50ng/mL IFN-γ را می توان اضافه کرد)	10 نانوگرم در میلی لیتر IL-4 (10 نانوگرم در میلی لیتر IL-13 را می توان اضافه کرد)
RAW264.7 سلول	DMEM	/	100 نانوگرم در میلی لیتر LPS	20 نانوگرم در میلی لیتر IL-4 (20 نانوگرم در میلی لیتر IL-10 را می توان اضافه کرد)

5. داده های سنجش

YEASEN مجموعه ای از محصولات سیتوکین HiActive® با فعالیت بالا مرتبط با کشت ماکروفاژها را برای حمایت از تحقیقات ماکروفاژها ارائه می دهد.

سیتوکین های بسیار فعال HiActive®：فعالیت بیولوژیکی هر سیتوکین برای اطمینان از فعالیت بالای سیتوکین تأیید شده است.

داده های تأیید فعالیت:

پروتئین نوترکیب M-CSF موش

شکل 1. اندازه گیری در روش تکثیر سلولی با استفاده از موش M‑NFS‑60 سلول های لنفوبلاست لوسمی میلوژن. ED50 برای این اثر معمولاً 16.74 -25.83 ng/ml است.

نوترکیب موس GM-CSF پروتئین

شکل 2. ED50 همانطور که توسط روش تکثیر سلولی با استفاده از سلول‌های FDC-P1 موش تعیین می‌شود 2.79-12.84 pg/mL است.

نوترکیب IL-10 انسانی پروتئین

شکل 3. ED50 با استفاده از روش تکثیر سلولی تعیین می شود سلول‌های MC/9 موش کمتر از 0.1 نانوگرم در میلی‌لیتر است که مربوط به ویژگی 10×1.0 است.⁷ IU/mg

محصولات مرتبط

طبقه بندی	گونه ها	گربه	مشخصات
G-CSF	انسان	91101ES	2 میکروگرم / 10 میکروگرم / 50 میکروگرم / 100 میکروگرم
	موش	91107ES	2 میکروگرم / 10 میکروگرم / 50 میکروگرم / 100 میکروگرم / 500 میکروگرم
M-CSF	انسان	91103ES	10 میکروگرم / 100 میکروگرم / 500 میکروگرم
	موش	91114ES	10 میکروگرم / 100 میکروگرم / 500 میکروگرم
GM-CSF	انسان	91102ES	5 میکروگرم / 50 میکروگرم / 100 میکروگرم / 500 میکروگرم
	موش	91108ES	10 میکروگرم/100 میکروگرم / 500 میکروگرم
IFN-γ	انسان	91204ES	20 میکروگرم / 50 میکروگرم / 100 میکروگرم / 500 میکروگرم
	موش	91212ES	5 میکروگرم / 50 میکروگرم / 100 میکروگرم / 500 میکروگرم
IL-4	انسان	90105ES	5 میکروگرم / 50 میکروگرم / 100 میکروگرم / 500 میکروگرم
	موش	90144ES	5 میکروگرم / 100 میکروگرم / 500 میکروگرم
IL-10	انسان	90109ES	2 میکروگرم / 10 میکروگرم / 50 میکروگرم / 100 میکروگرم / 500 میکروگرم
	موش	90149ES	2 میکروگرم / 10 میکروگرم / 50 میکروگرم / 100 میکروگرم / 500 میکروگرم
IL-13	انسان	90112ES	2 میکروگرم / 10 میکروگرم / 50 میکروگرم / 100 میکروگرم / 500 میکروگرم
	موش	90151ES	2 میکروگرم / 10 میکروگرم / 50 میکروگرم / 100 میکروگرم / 500 میکروگرم

مراجع

[1]Atri C، Guerfali FZ، Laouini D.نقش پلاریزاسیون ماکروفاژهای انسانی در التهاب در طی بیماری های عفونی. Int J Mol Sci. 2018 ژوئن 19; 19 (6): 1801.