1.پس زمینه لامینین 521

لامینین 521 (LN521) یک پروتئین چسبنده سلولی کلیدی در طاقچه سلول های بنیادی طبیعی و ماتریکسی برای کشت و گسترش سلول های بنیادی پرتوان جنینی انسان (hES) و القایی (hiPSC) است. LN521 به گیرنده های سطح سلول متصل می شود و مسیرهای سیگنال دهی سلولی را فعال می کند و در نتیجه سلول های عملکردی بیشتری تولید می کند.

لامینین 521 محیط زیست مرتبط با hPSC را در شرایط آزمایشگاهی بازتولید می کند، باعث افزایش چسبندگی، بقای بالا و خود تجدید قوی طولانی مدت hPSC می شود و یک پروتئین ماتریکس کلیدی است که از رشد سلول های بنیادی حمایت می کند و ثبات ساختار و عملکرد غشای پایه را حفظ می کند. لامینین 521 نیز یکی از متداول ترین ماتریس های کشت بدون مواد مغذی است. علاوه بر این، لامینین 521 می‌تواند به عبور تک سلولی کارآمد سلول‌های بنیادی با ثبات ژنتیکی و پرتوان بدون افزودن هیچ گونه مهارکننده آپوپتوز دست یابد. سلول ها در یک تک لایه یکنواخت بدون نیاز به برداشتن دستی هیچ ناحیه تمایز رشد می کنند. علاوه بر این، مطالعات نشان داده است که LN521 می تواند رشد PSC را برای بیش از 10 نسل بدون هیچ گونه نشانه ای از ناهنجاری های کاریوتیپ پشتیبانی کند و توانایی PSC را برای تمایز به سه لایه جوانه لایه داخلی، میانی و خارجی حفظ می کند.

شکل 1. ساختار لامینین 521 ^[1]

2. آزمایش پوشش لامینین

2.1 لامینین 521 تا 400 میکروگرم بر میلی لیتر را با آب دیونیزه استریل یا آب برای تزریق آماده کنید. توصیه می شود قبل از استفاده با 1×DPBS استریل (Ca++/Mg++) تا 100 میکروگرم بر میلی لیتر رقیق شود و سپس با DPBS استریل (Ca++/Mg++) تا غلظت کاری 5-10 میکروگرم بر میلی لیتر رقیق شود. غلظت پوشش بسته به نوع سلول های کشت شده متفاوت است و توصیه می شود برای تعیین غلظت پوشش بهینه برای سلول ها، پروتکل آزمایشی را بهینه کنید. برای غلظت های توصیه شده به جدول 1 مراجعه کنید.

توجه: DPBS حاوی Ca²⁺ و Mg²⁺ باید استفاده شود، زیرا کاتیون های دو ظرفیتی برای ساختار و عملکرد پروتئین مهم هستند. غلظت کاری مورد نیاز لامینین 521 به سلول ها و کاربرد بستگی دارد. ما غلظت پوشش اولیه 0.5μg/cm را توصیه می کنیم².

جدول 1. حجم های توصیه شده محلول کاری لامینین انسانی نوترکیب برای رگ های کشت مختلف.

ظرف پتری	غلظت پوشش (μg/mL)	مقدار اضافی LN521	مقدار اضافی 1 * DPBS	حجم کل
6 خوب	5	50 میکرولیتر / چاه	950 میکرولیتر در چاه	1 میلی لیتر / چاه
12 خوب	5	25 میکرولیتر / چاه	475 میکرولیتر در چاه	0.5 میلی لیتر در چاه
24 خوب	5	15 میکرولیتر / چاه	285 میکرولیتر در چاه	0.3 میلی لیتر در چاه
48 خوب	5	7.5 میکرولیتر در چاه	142.5 میکرولیتر در چاه	150 میکرولیتر / چاه
96 خوب	5	3.5 میکرولیتر در چاه	66.5 میکرولیتر / چاه	70 میکرولیتر در چاه
پتری دیش 35 میلی متری	5	50 میکرولیتر / چاه	950 میکرولیتر در چاه	1 میلی لیتر / چاه
پتری دیش 60 میلی متری	5	100 میکرولیتر / چاه	1900 میکرولیتر در چاه	2 میلی لیتر / چاه
پتری دیش 100 میلی متری	5	300 میکرولیتر در چاه	5700 میکرولیتر در چاه	6 میلی لیتر / چاه

حجم فوق بر اساس غلظت پوشش 5μg/mL است.

2.2 حجم مشخص شده مخلوط لامینین-DPBS را به هر چاهک اضافه کنید و به آرامی تکان دهید. مطمئن شوید که تمام سطح با محلول پوشش لامینین پوشانده شده است، زیرا سطوح بدون پوشش از رشد سلول پشتیبانی نمی کنند.

2.3. بشقاب را در انکوباتور 37 درجه سانتیگراد قرار دهید و یک شب در انکوباتور قرار دهید. حداقل زمان انکوباسیون 2 ساعت است، اما برای به دست آوردن شرایط کشت سلولی ایده آل، انکوباسیون یک شبه توصیه می شود. مراقب باشید که ظرف کشت خشک نشود که LN521 را غیرفعال می کند.

2.4. هنگامی که سلول ها آماده کاشت شدند، محلول لامینین 521 را آسپیره کنید.

3.iPSC Culture

3.1 ذوب iPSC (به عنوان مثال صفحه 12 چاهی را در نظر بگیرید)

3.1.1 iPSC ها را از نیتروژن مایع یا یخ خشک خارج کرده و در آب 37 درجه سانتی گراد به مدت 10 ثانیه ذوب کنید.

3.1.2 کرایویال ها را با الکل 75 درصد استریل کرده و به سطح کار منتقل کنید.

3.1.3 سلول ها را به یک لوله سانتریفیوژ 15 میلی لیتری جدید حاوی 9 میلی لیتر DMEM-F12 منتقل کنید.

3.1.4 لوله سانتریفیوژ 15 میلی لیتری را در 300 گرم به مدت 5 دقیقه در دمای اتاق سانتریفیوژ کنید.

3.1.5 محلول لامینین را از صفحه 12 چاهی پوشش داده شده دور بریزید.

3.1.6 مایع رویی سلول را دور بریزید و iPSCها را به آرامی در 1 میلی لیتر mTeSR-plus (حاوی 10 میکرومولار Y-27632) معلق کنید و آنها را به صفحه 12 چاهی پوشش داده شده منتقل کنید. صفحه را تکان دهید تا سلول ها به طور یکنواخت به تراکم سلولی نهایی 1×10^5 سلول در چاه توزیع شوند و اجازه دهید به مدت 10 دقیقه در دمای اتاق بماند. اطمینان حاصل کنید که فرهنگ طی 4-5 روز منتقل شده است.

3.1.7 صفحه 12 چاهی را برای جوجه کشی به انکوباتور 37 درجه سانتیگراد برگردانید.

3.1.8 محیط کشت حاوی بازدارنده ROCK باید پس از 12-16 ساعت برداشته شود و در محیط بدون بازدارنده به کشت ادامه یابد.

جدول 2. تراکم بذر سلولی در رگ های کشت مختلف، تعداد سلول ها با توجه به سرعت رشد سلول تعیین می شود.

عروق کشت سلولی	6 خوب	12 خوب	24 خوب	96 خوب
شماره همراه	2.5 ~ 3.5 × 105	6 ~ 8 × 104	3 ~ 4 × 104	0.5 ~ 1 × 104

3.2. پروتکل iPSC Passaging

3.2.1 مایع رویی کشت را دور بریزید و با 1 میلی لیتر PBS (Ca^---/Mg^---).

توجه: از PBS بدون Ca2+ و Mg2+ استفاده کنید، زیرا کاتیون های دو ظرفیتی تأثیر منفی بر برخی آنزیم های تجزیه دارند.

3.2.2 PBS را دور بریزید و 0.5 میلی لیتر معرف جداسازی سلولی ملایم را اضافه کنید.در دمای اتاق به مدت 6-8 دقیقه انکوبه کنید یا زیر میکروسکوپ مشاهده کنید تا سلول ها دیگر به صفحه متصل نشوند.

3.2.3 حجم مساوی DMEM-F12 اضافه کنید، سلول ها را به آرامی مخلوط کنید، به لوله سانتریفیوژ در دمای اتاق منتقل کنید و به مدت 5 دقیقه در 300 گرم سانتریفیوژ کنید.

3.2.4 قبل از عبور سلول ها، یک صفحه 12 چاهی با پوشش لامینین تهیه کنید.

3.2.5  مایع رویی را دور بیندازید و سلول ها را در محیط mTeSR-plus حاوی 10 معلق مجدد کنید.  میکرومولار  Y‑27632.

3.2.6 سلول ها را به صفحه 12 چاهی آماده شده با پوشش لامینین منتقل کنید. بشقاب را به آرامی تکان دهید تا سلول ها به طور مساوی توزیع شوند و به مدت 10 تا 20 دقیقه در دمای اتاق بگذارید.

3.2.7 صفحه 12 چاهی را در انکوباتور 37 درجه سانتیگراد قرار داده و انکوبه کنید.

توجه: iPSCها پس از رشد به صورت تک لایه به سرعت متمایز می شوند و می میرند. برای حفظ رشد و پرتوانی، قبل از اینکه به هم متصل شوند، باید از آنها عبور کرد.

3.3. انجماد iPSC

3.3.1 معرف تفکیک سلولی ملایم را آماده کنید.

3.3.2 جداسازی سلول را طبق پروتکل عبور iPSC انجام دهید، از شمارش اندامک های سلولی برای اطمینان از تراکم سلول قبل از انجماد استفاده کنید.

3.3.3 هر لوله سلولی باید با تراکم سلولی 1-2×10^6 منجمد شود. مراحل سانتریفیوژ و حذف محیط کشت سلولی را در پروتکل پاساژ iPSC دنبال کنید. گلوله iPSC جدا شده را در حجم مناسبی از محلول انجماد مجدد معلق کنید

3.3.4 1 میلی لیتر گلوله انجماد سلولی معلق مجدد را به یک لوله انجماد 1.5 میلی لیتری اضافه کنید، خنک سازی برنامه را انجام دهید و سپس برای نگهداری طولانی مدت به نیتروژن مایع منتقل کنید.

4. نکات مهم در مورد پوشش لامینین

4.1. تمام مراحل پروتکل آزمایشی باید در شرایط استریل انجام شود.

4.2. از قرار دادن لامینین در دمای اتاق به مدت طولانی خودداری کنید.

4.3. از انجماد و ذوب مکرر خودداری کنید

4.4. پس از ذوب، محلول ذخیره پروتئین رقیق نشده را می توان در دمای 2 تا 8 درجه سانتیگراد در شرایط استریل نگهداری کرد و می توان آن را به مدت حداقل 3 ماه به طور پایدار نگهداری کرد.

5. اطلاعات مربوط به محصول

نام محصول	گربه#	اندازه
پروتئین نوترکیب لامینین انسانی 521 (بدون حیوانات)	92602ES	10μg/100μg/500μg/1mg

6. مراجع

[1] Pulido D، Briggs DC، Hua J، Hohenester E. تجزیه و تحلیل کریستالوگرافی بازوی کوتاه β2 لامینین نشان می دهد که چگونه دامنه LF در یک آرایه منظم از دامنه های LE قرار می گیرد. Matrix Biol. 2017 ژانویه؛ 57-58:204-212.