فناوری تقویت همدما می تواند به هدف تقویت توالی های اسید نوکلئیک خاص در شرایط دمای ثابت دست یابد. با توجه به ویژگی های عدم وجود تجهیزات خاص، زمان تقویت کوتاه و حساسیت بالا، چشم انداز کاربردی خوبی در تشخیص در محل و تشخیص نقطه مراقبت از خود نشان داده است و برای توسعه ابزارهای تشخیص مولکولی بسیار مناسب است.

در زمینه همه‌گیری کروناویروس جدید با افزایش سویه‌ها و عفونت‌پذیری، فناوری تقویت همدما می‌تواند کروناویروس جدید را شناسایی کند. به سرعت با ابزارهای ساده، به حل این مشکل کمک می کند که برخی از بیماران COVID-19 به دلیل زمان تشخیص طولانی و نیازهای بالا برای تجهیزات تشخیص و معرف های تکنیک های سنتی PCR به سرعت تایید نمی شوند. بنابراین اصل RT-LAMP، یکی از تکنیک های تقویت همدما چیست؟ مواد اولیه با کیفیت بالا که Yeasen می تواند ارائه دهد چیست؟

1. اصل RT-LAMP چیست؟
2. طراحی پرایمر برای RT-LAMP
3. Yeasen چه مواد اولیه ای را می تواند تهیه کند؟
4. راهنمای انتخاب محصول

1. اصل RT-LAMP چیست؟

در سال 2000، محققین ژاپنی نوتومی و دیگران یک فناوری جدید تقویت اسید نوکلئیک به نام تقویت همدما با واسطه حلقه (LAMP) ایجاد کردند. LAMP از 4 آغازگر ویژه طراحی شده برای 6 ناحیه از ژن هدف استفاده می کند و از DNA پلیمراز جابجایی رشته برای تکثیر 109 نسخه از توالی هدف در ده ها دقیقه در شرایط همدما (60 ~ 65 ℃) استفاده می کند. نتایج با الکتروفورز ژل آگارز مورد قضاوت قرار گرفت و نتایج مثبت نوارهای نردبانی شکل را نشان داد. LAMP دارای ویژگی های ویژگی قوی، حساسیت بالا، عملکرد سریع و ساده و هزینه کم است. با بهبود مستمر و کمال این فناوری، در حال حاضر در تشخیص میکروارگانیسم های بیماری زا مختلف استفاده می شود.

RT-LAMP روشی است که در آن رونوشت معکوس به سیستم تقویت LAMP اضافه می شود، که می تواند تشخیص مستقیم RNA ویروسی را محقق کند. راندمان تقویت LAMP بسیار بالا است، بنابراین مقدار زیادی از اسید نوکلئیک را می توان تنها با مقدار کمی cDNA تقویت کرد. زمان رونویسی معکوس در فرآیند تقویت اسید نوکلئیک ذخیره می شود و سرعت تشخیص RNA تسریع می شود.

DNA در حدود 65 درجه در حالت تعادل دینامیکی است. تحت عمل DNA پلیمراز جابجایی رشته، با شروع از انتهای 3' بخش F2 پرایمر FIP، با توالی مکمل DNA الگو جفت می شود تا سنتز DNA جابجایی رشته را آغاز کند. پرایمر F3 مکمل F3c در انتهای جلویی F2c است و انتهای 3' را به عنوان نقطه شروع سنتز DNA خود می گیرد در حالی که جایگزین رشته DNA سنتز شده توسط پرایمر اصلی FIP با عمل DNA پلیمراز جابجایی رشته می شود. به جلو گسترش دهید. رشته DNA سنتز شده توسط پرایمر نهایی F3 یک رشته دوتایی را با یک رشته DNA الگو تشکیل می دهد. رشته DNA سنتز شده توسط پرایمر FIP با رشته پرایمر F3 جایگزین می شود تا یک رشته تولید شود. این تک رشته دارای بخش های F1c و F1 مکمل در انتهای 5' است، بنابراین جفت شدن خود پایه برای تشکیل یک ساختار دایره ای انجام می شود. و پرایمر BIP هیبرید شده و با تک رشته ترکیب می شود و انتهای 3' پرایمر BIP به عنوان نقطه شروع برای سنتز یک رشته مکمل استفاده می شود و ساختار در این فرآیند باز می شود.سپس پرایمرهای مشابه F3 و B3 از پرایمر BIP وارد می‌شوند، جفت‌سازی مکمل پایه انجام می‌شود و یک رشته مکمل جدید از انتهای 3' به عنوان نقطه شروع سنتز می‌شود. توالی‌های مکمل در هر دو انتهای DNA تک رشته‌ای جایگزین شده وجود دارد، و جفت شدن خود پایه برای تشکیل یک ساختار دایره‌ای رخ می‌دهد، بنابراین کل زنجیره ساختاری شبیه دمبل را ارائه می‌کند. این ساختار ساختار شروع چرخه تقویت روش RT-LAMP است.

در ساختار دمبلی شکل، گسترش DNA با استفاده از بخش F1 در انتهای 3' به عنوان نقطه شروع و با استفاده از خود به عنوان یک الگو انجام می شود. و پرایمر FIP F2 با F2c تک رشته ای روی حلقه هیبرید می شود تا دور جدیدی از واکنش جابجایی رشته را آغاز کند. اسید نوکلئیک دو رشته ای سنتز شده از بخش F1 جدا می شود و به طور مشابه، یک ساختار دایره ای روی اسید نوکلئیک تشکیل می شود. یک شکل تک رشته ای از B2c روی ساختار دایره ای وجود دارد و B2 روی پرایمر BIP با آن هیبرید می شود تا دور جدیدی از تقویت را آغاز کند و یک ساختار دایره ای از طریق همین فرآیند تشکیل می شود. طبق این فرآیند، توالی‌های مکمل روی یک رشته از طریق جفت شدن، گسترش رشته‌ها و در نهایت ساختارهایی با اندازه‌های مختلف تشکیل می‌شوند.

2. طراحی پرایمر برای RT-LAMP

طراحی پرایمر کلید تقویت و تشخیص موفق RT-LAMP است. پرایمرهای RT-LAMP شامل دو پرایمر خارجی (F3 و B3) و دو پرایمر داخلی (FIP و BIP) می باشد. پرایمر F3: پرایمر بیرونی بالادست، متشکل از ناحیه F3، مکمل ناحیه F3c ژن هدف است. پرایمر FIP: پرایمر داخلی بالادست، متشکل از ناحیه F2، ناحیه F2c در انتهای '3 ژن هدف در ناحیه F2 مکمل منطقه F1c در انتهای '5' ژن هدف است. پرایمر BIP: پرایمر داخلی پایین دست، متشکل از ناحیه B2، ناحیه B2 مکمل ناحیه B2c در انتهای '3' ژن هدف است و دارای همان توالی منطقه B1c در انتهای '5' ژن هدف است.

مشابه PCR، اصول طراحی پرایمر باید به عواملی مانند ترکیب پایه، محتوای GC و زیرساخت توجه داشته باشد. در ضمن به نکات زیر نیز باید توجه داشت. بخش انتهایی 5' پرایمرهای داخلی FIP و BIP، یعنی F1c و B1c، معمولاً 50-8 جفت باز طول دارند. طول ترجیحاً 15 تا 25 جفت باز است و مقدار Tm بیشتر از مقادیر Tm F2 و B2 در قسمت انتهایی 3' است. قسمت های انتهایی 3 پرایمرهای داخلی FIP و BIP، یعنی F2 و B2، معمولاً 50-8 جفت باز طول دارند. طول ترجیحاً 15-25 جفت باز است و مقدار Tm با دمای بهینه DNA پلیمراز Bst انتخاب شده در آزمایش مطابقت دارد. طول پرایمرهای خارجی F3 و B3 عموماً 50-8 جفت باز است. طول ترجیحاً 15-25 جفت باز است و مقدار Tm آن کوچکتر از F2 و B2 است. هنگام طراحی پرایمرها، ساختار حلقه و اندازه دنباله هدف باید در نظر گرفته شود. هنگامی که تعداد پایه ها در حلقه بیشتر از 40bp و اندازه دنباله هدف 130-200bp باشد، بازده تقویت بالاترین است.

3. Yeasen چه مواد اولیه ای را می تواند تهیه کند؟

3.1 [ارتقای جدید] Yeasen Bst به علاوه DNA پلیمراز

به تازگی ارتقا یافته است Hieff™ Bst Plus DNA Polymerase (Cat#14402ES, 14403ES) با بیان و خالص سازی ژن DNA پلیمراز Bacillus stearothermophilus به دست می آید. sp فاقد دامنه اگزونوکلئاز 5'→3' در E.coli.توانایی جابجایی رشته آنزیمی قوی است و دارای مزایای حساسیت بالا، راندمان تقویت بالا و تحمل dUTP بالا است و می تواند به طور گسترده در تشخیص بیدرنگ پاتوژن ها بر اساس فناوری تقویت همدما استفاده شود.

3.1.1 حساسیت سریع و بالا

Yeasen Hieff™ Bst Plus DNA Polymerase حساسیت بالایی دارد و می تواند ژن هدف را تا 5 کپی تشخیص دهد. مقدار قالب در سطح فمتوگرام (fg) است و نرخ تقویت سریعتر از محصولات رقیب است.

شکل 1. واکنش RT-LAMP با Yeasen انجام شد Hieff™ Bst Plus DNA Polymerase (نارنجی) و آنزیم Bst رقیب N (خاکستری) و رقیب T (آبی) برای تقویت SARS-CoV-2. نتایج نشان می‌دهد که Yeasen Hieff™ Bst Plus DNA Polymerase همیشه می‌تواند سریع‌تر از محصولات رقیب به آستانه برسد و نرخ تقویت سریع‌تر است.

4. راهنمای انتخاب محصول

محصولات ارائه شده توسط Yeasen به شرح زیر است:

جدول 1.اطلاعات محصول