آنتی بادی ضد TAQ DNA آنتی بادی پلیمراز DNA دو بلوک برای کمک به کاهش تقویت غیر اختصاصی

تشخیص مولکولی سریعترین زیرشاخه در حال توسعه در زمینه IVD است. از مزایای زمان تشخیص کوتاه، حساسیت بالا و ویژگی قوی برخوردار است. این به طور گسترده ای در تشخیص تومور و غربالگری بیماری های عفونی و بیماری های ژنتیکی استفاده می شود. در زمینه تشخیص مولکولی، PCR نه تنها بالغ‌ترین پلت‌فرم فناوری با بیشترین سهم بازار، بلکه فناوری «استاندارد طلایی» تشخیص بالینی است. در واکنش سنتی PCR، مشکل تقویت غیر اختصاصی اغلب رخ می دهد. تقویت غیر اختصاصی مستقیماً بر تفسیر نتایج تشخیص تأثیر می گذارد و منجر به کاهش حساسیت تقویت و حتی بازده قطعات هدف می شود. چگونه تقویت غیر اختصاصی رخ می دهد و چگونه می توان به طور موثر از آن جلوگیری کرد؟

1. DNA پلیمراز معمولی می تواند منجر به تقویت غیر اختصاصی شود

2. پلیمراز استارت داغ می تواند ویژگی تقویت را بهبود بخشد

3. آنتی بادی دو بلوک Taq می تواند ویژگی و پایداری تقویت را دو برابر بهبود بخشد

4. نمایش عملکرد Taq دوبلوک Yeasen آنتی بادی

5. اطلاعات محصول

1. DNA پلیمراز معمولی می تواند منجر به تقویت غیر اختصاصی شود

ویژگی توالی ضعیف پرایمرها علت مستقیم تقویت غیراختصاصی است. به عنوان پروموتر DNA پلیمراز معمولی، فعالیت اگزونوکلئاز آن می تواند توالی پرایمر DNA را در طول آماده سازی سیستم PCR کوتاه کند تا ویژگی پرایمرها کاهش یابد.

علاوه بر این، DNA پلیمراز معمولی نه تنها دارای فعالیت اگزونوکلئازی است، بلکه دارای فعالیت پلیمراز نیز می باشد. اگرچه دمای بهینه گسترش DNA پلیمراز 72 درجه سانتیگراد است، پلیمراز هنوز در دمای اتاق فعال است. بنابراین، در طول آماده‌سازی واکنش PCR و فرآیند گرمایش اولیه، پرایمرها ممکن است اتصال غیراختصاصی با برخی از قالب‌های تک رشته‌ای ایجاد کنند و تحت تأثیر Taq DNA پلیمراز گسترش پیدا کنند و در نتیجه توالی‌های غیرهدف تقویت شوند و بر ویژگی واکنش تأثیر بگذارند.

بنابراین، سیستم های PCR اغلب روی یخ پیکربندی می شوند تا از فعالیت DNA پلیمراز جلوگیری کنند. اگرچه این روش ساده و ارزان است، اما نمی تواند به طور کامل فعالیت آنزیم را مهار کند، بنابراین نمی تواند تقویت محصولات غیر اختصاصی را از بین ببرد.

2. پلیمراز شروع داغ می تواند ویژگی تقویت را بهبود بخشد

پلیمراز شروع داغ جزء اصلی PCR شروع گرم است. در دمای اتاق، محل فعال DNA پلیمراز توسط یک اصلاح کننده آنزیم مسدود می شود. تنها پس از دناتوره شدن PCR در دمای 95 درجه سانتیگراد، اصلاح کننده آنزیم از بین می رود و فعالیت آنزیم شروع می شود و از تقویت غیر اختصاصی ناشی از آنزیم جلوگیری می کند.

در حال حاضر، روش های متداول اصلاح شروع داغ DNA پلیمراز در بازار عمدتاً شامل روش شیمیایی، روش لیگاند و روش آنتی بادی است. در میان آنها، اثر مسدودکننده پلیمراز شروع گرم اصلاح شده با آنتی بادی بهترین است و سرعت آزادسازی فعالیت آنزیم سریع است که می تواند زمان واکنش PCR را تا حد زیادی کاهش دهد. این یک روش اصلاح آنزیم شروع داغ است که به طور گسترده در بازار IVD استفاده می شود.

با این حال، باید توجه داشت که روش سنتی شروع داغ آنتی بادی تنها فعالیت پلیمراز 5'→3' Taq DNA پلیمراز را مسدود می کند، که تنها می تواند از تقویت غیر اختصاصی ناشی از عدم تطابق یا دایمر پرایمر در دماهای پایین جلوگیری کند.با این حال، همانطور که در بالا ذکر شد، Taq DNA پلیمراز نه تنها دارای فعالیت پلیمراز 5'→3' است بلکه دارای فعالیت اگزونوکلئاز 5'→ 3' نیز می باشد. این فعالیت اگزونوکلئاز ممکن است منجر به تخریب کاوشگرهای نامتناسب یا سایر مواد در دماهای پایین شود و در نتیجه برخی سیگنال های غیر اختصاصی ایجاد شود.

3. آنتی بادی دو بلوکی Taq می تواند ویژگی و پایداری تقویت را دو برابر بهبود بخشد

Yeasen Biotechnology (Shanghai) Co., Ltd. (که از این پس Yeasen نامیده می شود) به عنوان یک رهبر نوآور در صنعت آنزیم های مولکولی داخلی، بر تحقیق و توسعه و تولید مواد خام آنزیمی مولکولی تمرکز دارد و جرات نوآوری را دارد. با تکیه بر پلت فرم غربالگری آنتی بادی بالغ خود، آنتی بادی مسدود کننده را با Taq DNA پلیمراز به عنوان مولکول هدف غربال می کند. پس از سالها تحقیق پر زحمت و بهینه سازی سیستم، توسعه یافته است آنتی بادی دوبلوک ضد تاک DNA پلیمرازنه تنها می تواند فعالیت پلیمراز Taq DNA پلیمراز را مسدود کند، بلکه می تواند فعالیت اگزونوکلئاز Taq DNA پلیمراز را نیز مسدود کند. در یک رویکرد دو طرفه، نه تنها می تواند به طور موثر از تقویت غیر اختصاصی ناشی از عدم تطابق یا دایمر پرایمر جلوگیری کند، بلکه از تخریب مواد از تولید سیگنال های غیر اختصاصی جلوگیری می کند و پایداری معرف را دوچندان می کند.

4. نمایش عملکرد Yeasen's Double-Block Taq آنتی بادی

4.1 استفاده از آنتی بادی دو بلوک Taq دقیق و حساس تر است

پس از مسدود کردن Taq پلیمراز با آنتی بادی دوبلوک Yeasen و آنتی بادی شرکت T، نمونه های مثبت با ARMS-PCR شناسایی شدند.

شکل 1. منحنی تقویت ARMS-PCR. آبی: آنتی بادی مسدودکننده شرکت T. قرمز: آنتی بادی دوبلوک Yeasen

از شکل 1 می توان دریافت که پلیمراز Taq مسدود شده توسط آنتی بادی دوبلوک Yeasen دارای تایپ دقیق و حساسیت بالاتر در تقویت ARMS-PCR است.

4.2 آنتی بادی دو بلوک Taq به طور موثر فعالیت اگزونوکلئاز Taq DNA Polymerase را مسدود کرد

پروب های آغازگر سنتز شده با محلول واکنش Taq DNA پلیمراز که به ترتیب توسط آنتی بادی های بسته نشده و دوبل بلوک شده مسدود شده است مطابقت داده شدند و در دمای 40 درجه سانتیگراد برای تشخیص سیگنال های فلورسانس آنها واکنش نشان دادند.

شکل 2. تشخیص کارایی مسدودکننده آنتی بادی دوبلوک برای فعالیت اگزونوکلئاز. زرد: گروه پلیمراز Taq DNA بسته نشده. بنفش: گروه Taq DNA پلیمراز توسط آنتی بادی دوبلوک مسدود شده است

از شکل 2 قابل مشاهده است که آنتی بادی دوبلوک می تواند به طور موثری فعالیت اگزونوکلئاز Taq DNA پلیمراز را مسدود کند.

4.3 آنتی بادی دو بلوکی Taq می تواند به طور موثری پایداری معرف تشخیص را بهبود بخشد

Taq DNA پلیمراز به ترتیب با آنتی بادی مسدود کننده سنتی و آنتی بادی دوبلوک مسدود شد و در یک پیش مخلوط کامل حاوی پروب آغازگر پیکربندی شد. 10000 نسخه از پلاسمید ASF در دمای 4 درجه سانتیگراد به مدت 10 روز یا در دمای 37 درجه سانتیگراد به مدت 1، 3 و 5 روز تکثیر شد. منحنی تقویت و تغییرات مقدار Ct مشاهده شد، و اثرات آنتی بادی مسدود کننده سنتی و آنتی بادی دوبلوک بر پایداری محلول واکنش کامل پیش مخلوط مقایسه شد.

شکل 3.منحنی تقویت 10000 کپی از پلاسمید ASF تقویت شده توسط آنتی بادی مسدود کننده سنتی (a) و آنتی بادی دوبلوک (b) محلول واکنش مسدود کننده. آبی: در دمای 4 درجه سانتیگراد به مدت 10 روز ذخیره کنید. قرمز: قرار داده شده در دمای 4 درجه سانتیگراد به مدت 0 روز (کنترل)

از شکل 3 می توان دید که آنتی بادی دوبلوک می تواند پایداری محلول واکنش را حفظ کرده و به طور موثری پایداری معرف تشخیص را نسبت به آنتی بادی مسدود کننده سنتی بهبود بخشد. منحنی تقویت و مقدار Ct پس از مسدود شدن کل پیش مخلوط حاوی پروب پرایمر توسط آنتی بادی دوبلوک و قرار دادن آن در دمای 4 درجه سانتیگراد به مدت 10 روز تغییر معنی داری نداشت.

شکل 4. منحنی تقویت 10000 نسخه از پلاسمید ASF تقویت شده توسط آنتی بادی مسدود کننده سنتی (a) و محلول واکنش مسدود کننده آنتی بادی دوبلوک (b). آبی: در دمای 37 درجه سانتیگراد به مدت 5 روز ذخیره کنید. سبز: 37 درجه سانتیگراد به مدت 3 روز؛ زرد: 37 ℃ برای 1 روز؛ قرمز: قرار داده شده در دمای 37 درجه سانتیگراد به مدت 0 روز (کنترل)

از شکل 4 می توان دید که آنتی بادی دوبلوک می تواند پایداری محلول واکنش را حفظ کند و به طور موثری پایداری معرف تشخیص را نسبت به آنتی بادی مسدود کننده سنتی بهبود بخشد. آنتی بادی دوبلوک کل پیش مخلوط حاوی پرایمر-پراب را مسدود می کند و اختلاف مقدار Ct پس از قرار گرفتن در دمای 37 درجه سانتیگراد به مدت 1، 3 و 5 روز کمتر از 0.2 است.

4.4 آنتی بادی دو بلوکی Taq به حل مشکل دریفت خط پایه کمک می کند

هنگامی که برخی از آغازگرها با یک بافر و ابزار خاص همکاری می کنند، رانش خط پایه وجود خواهد داشت. Yeasen روش‌های زیادی را برای بهبود مشکل پایه امتحان کرد و دریافت که آنتی‌بادی دوبلوک برای یک خط پایه پایدار بیشتر است.

شکل 5. منحنی تقویت ژن N (a) و ژن ACT (b). قرمز: آنتی بادی مسدود کننده سنتی؛ سبز: آنتی بادی دوبلوک

همانطور که از شکل 5 مشاهده می شود، استفاده از آنتی بادی های دوبلوک تحت پرایمرها و بافرهای خاص می تواند به حل مشکل رانش خط پایه کمک کند.

4.5 خطی خوبی با استفاده از آنتی بادی Taq دو بلوکی به دست آمد

100000، 10000، 1000 و 100 نسخه از پلاسمیدهای دوگانه ASF/ACT با محلول واکنش مسدود شده توسط آنتی بادی دوبلوک تکثیر شدند و منحنی استاندارد ساخته شد.

شکل 6. منحنی های استاندارد ژن ASF (a) و ژن ACT (b) تولید شده توسط محلول واکنش دوبلوک

همانطور که از شکل 6 مشاهده می شود، منحنی استاندارد R2 است از ژن ASF 0.998، و بازده تقویت 98.848٪ است. منحنی استاندارد R2 از ژن ACT 0.998 و راندمان تکثیر 98.113 درصد بود.

4.6 دو بلوک تاک آنتی بادی می تواند به سرعت فعالیت آنزیم را آزاد کند

Taq پلیمراز با آنتی بادی وارداتی شرکت T مسدود شد و آنتی بادی دوبلوک Yeasen (cat#31303) به ترتیب، و فعالیت آنزیم پس از شوک حرارتی در دمای 95 درجه سانتیگراد به مدت 20 ثانیه شناسایی شد. مشاهده می شود که 31303 می تواند بیش از 95٪ از فعالیت آنزیم را پس از شوک حرارتی در دمای 95 درجه سانتیگراد به مدت 20 ثانیه آزاد کند که معادل آنتی بادی شرکت T است.

جدول 1. فعالیت آنزیم

4.7 تاک دوبلوک آنتی بادی می تواند بسیاری از انواع آنزیم های Taq را مسدود کند

سه نوع آنزیم Taq (نوع وحشی و جهش 2) توسط آنتی بادی دوبلوک Yeasen (cat#31303) مسدود شدند و نسبت مسدودکننده 1 میکروگرم: 5 U بود که مقدار فلورسانس و کارایی آب بندی را اندازه می‌گرفت. مشاهده می شود که اثر مسدود کننده آنتی بادی دوبلوک Yeasen (cat#31303) برای انواع مختلف آنزیم Taq بهتر است.

جدول 2. کارایی مسدود کردن انواع مختلف آنزیم Taq

4.8 Yeasen's آنتی بادی دو بلوک Taq هیچ باقیمانده ژنومی در موش نداشت

با در نظر گرفتن آب به عنوان الگوی کنترل منفی و ژنوم موش به عنوان الگوی کنترل مثبت، 31303 دسته مختلف تکثیر شدند. مشخص شد که قطعه هدف در نمونه تکثیر نشده است و این نشان می دهد که هیچ باقیمانده ژنوم موش در آنتی بادی وجود ندارد.

شکل 7. نمودار تشخیص باقیمانده ژنوم موش

نکته: - کنترل منفی است، + کنترل مثبت است و 1-5 31303 نمونه از دسته های مختلف است.

5. اطلاعات محصول