تکثیر غیراختصاصی Taq DNA پلیمراز یک مسئله رایج در آزمایشات PCR است که به طور مستقیم بر تفسیر نتایج تشخیص تأثیر می گذارد و می تواند منجر به کاهش حساسیت تقویت و حتی کاهش بازده قطعه هدف شود. استفاده از اصلاح کننده های آنزیمی برای مهر و موم کردن مرکز فعال Taq DNA پلیمراز در دمای اتاق، در نتیجه مهار فعالیت DNA پلیمراز آنزیم Taq در دمای اتاق، در حال حاضر موثرترین روش برای سرکوب تقویت غیراختصاصی است. آنتی بادی های مهر و موم دوگانه توسعه یافته توسط Yisheng نه تنها فعالیت پلیمراز Taq DNA پلیمراز را مهر و موم می کنند، بلکه به طور همزمان فعالیت اگزونوکلئاز Taq DNA پلیمراز را نیز مهر و موم می کنند. این رویکرد دوگانه به طور موثر از تقویت غیر اختصاصی ناشی از جفت نادرست یا دایمرهای پرایمر جلوگیری می کند و همچنین از تولید سیگنال های غیر اختصاصی به دلیل تخریب مواد جلوگیری می کند و در نتیجه ویژگی معرف را دو برابر افزایش می دهد. این معرف‌های تشخیص را قادر می‌سازد تا با حمل و نقل یا استفاده در دمای اتاق به راحتی کنار بیایند.

1.ویژگی تقویت فوق العاده بالا - آنتی بادی دو مهر و موم شده می تواند به طور همزمان هر دو فعالیت پلیمراز و اگزونوکلئاز را مهر و موم کند، به طور موثر از تقویت غیر اختصاصی جلوگیری کرده و ویژگی را افزایش می دهد.

2.حساسیت تشخیص استثنایی - فرمول شروع داغ تشخیص موثر ژن‌های با فراوانی کم را تضمین می‌کند و حساسیت بالاتری را ارائه می‌دهد.

3.پایداری محصول فوق‌العاده - زمانی که در دمای 37 درجه سانتی‌گراد به مدت 5 روز یا در دمای 4 درجه سانتی‌گراد به مدت 10 روز قرار می‌گیرد، در عملکرد پایدار است.

4.ثبات خط پایه و خطی بودن خوب - پرداختن به موضوع رانش خط پایه، که منجر به خطی بودن عالی می شود.

5.آزادسازی سریع فعالیت آنزیم - بیش از 95 درصد از فعالیت آنزیم را می توان با حرارت دادن در دمای 95 درجه سانتی گراد به مدت 20 ثانیه آزاد کرد.

6.کاربرد گسترده آنزیم ها - مناسب برای آنزیم های Taq نوع وحشی و جهش یافته، با هر میلی گرم آنتی بادی که می تواند 4-10 KU آنزیم Taq را ببندد.

1 مسدود کردن فعالیت اگزونوکلئاز DNA پلیمراز Taq

پروب‌های آغازگر مصنوعی به ترتیب در مخلوط‌های واکنش Taq DNA پلیمراز که یا بدون مهر و موم شده بودند یا با آنتی‌بادی‌های بسته دوگانه مهر و موم شده بودند، وارد شدند و واکنش‌ها در دمای 40 درجه سانتی‌گراد انجام شد. سیگنال‌های فلورسانس هر دو شناسایی شد، و مشخص شد که آنتی‌بادی‌های بسته دوگانه می‌توانند به طور موثری فعالیت اگزونوکلئاز Taq DNA پلیمراز را مهر و موم کنند.

شکل 2. تشخیص کارایی آب بندی فعالیت آنتی بادی-اندونوکلئاز دو مهر و موم شده.

02 تأیید حساسیت تشخیص

به ترتیب با استفاده از آنتی بادی دو مهر و موم شده Yeasen و آنتی بادی شرکت T برای آب بندی آنزیم Taq و به دنبال آن تشخیص نمونه های مثبت از طریق فناوری ARMS-PCR، مشخص شد که آنزیم Taq مهر و موم شده توسط آنتی بادی دو مهر و موم Yeasen در تقویت ARMS-PCR با حساسیت بالاتری دقیق است.

قرمز: آنتی بادی YEASEN + Taq; آبی: تامین کننده آنتی بادی + Taq.

شکل 3. منحنی تقویت ARMS-PCR.

03 تأیید پایداری (4 درجه سانتیگراد برای 10 روز، 37 درجه سانتیگراد برای 5 روز).

با استفاده از آنتی‌بادی‌های بسته سنتی و آنتی‌بادی‌های دوبار بسته به ترتیب برای مسدود کردن Taq DNA پلیمراز، پلیمراز سپس به یک محلول پیش مخلوط کامل حاوی پرایمرها و پروب‌ها فرموله می‌شود. این محلول به مدت 10 روز در دمای 4 درجه سانتیگراد یا به مدت 1، 3 و 5 روز در دمای 37 درجه سانتیگراد باقی می ماند و سپس برای تقویت 10000 نسخه از پلاسمید ASF استفاده می شود. مشاهده شد که تغییرات قابل توجهی در منحنی های تقویت و مقادیر Ct وجود ندارد.

شکل 4. منحنی های تقویت 10000 نسخه از پلاسمید ASF پس از مسدود شدن Taq پلیمراز با آنتی بادی مسدود کننده سنتی (A) و آنتی بادی دوبلوک (B)، تقویت شده توسط سیستم qPCR.

04 تشخیص پایه

در شرایط خاصی که پرایمرهای خاص همراه با بافرها و ابزارهای خاص مورد استفاده قرار می گیرند، ممکن است پدیده ای به نام رانش خط مبنا رخ دهد. با این حال، استفاده از آنتی‌بادی‌های دوبار بسته می‌تواند به طور مؤثری مسئله رانش خط پایه را برطرف کند، در نتیجه یک خط پایه پایدارتر را تسهیل می‌کند.

شکل 5. منحنی های تقویت ژن SARS-CoV-2 N (A) و ژن ACT (B) در تجزیه و تحلیل qPCR.

05 تایید خطی بودن

مخلوط واکنش مهر و موم شده با آنتی بادی های دوبار بسته برای تقویت 100000، 10000، 1000 و 100 نسخه از پلاسمید دوگانه ASFV/ACT برای تولید یک منحنی استاندارد استفاده شد. همانطور که از شکل 7 مشاهده می شود، هر دو خطی بودن خوبی از خود نشان می دهند.

شکل 6. نمودارهای منحنی استاندارد برای ژن ASFV و ژن ACT که با استفاده از مخلوط واکنش دوبلوک تولید شده است.

06 سنجش رهاسازی فعالیت آنزیمی

با استفاده از آنتی‌بادی‌های دوبار بسته (Cat#31303) از Yeasen برای مهر و موم کردن آنزیم Taq و قرار دادن آن در معرض شوک حرارتی در دمای 95 درجه سانتی‌گراد به مدت 20 ثانیه، فعالیت آنزیمی تشخیص داده شد. می توان مشاهده کرد که پس از شوک حرارتی 20 ثانیه ای در دمای 95 درجه سانتی گراد، 31303 می تواند بیش از 95 درصد از فعالیت آنزیمی را آزاد کند که با آنتی بادی های شرکت T قابل مقایسه است.

جدول 1. شوک حرارتی در دمای 95 درجه سانتیگراد به مدت 20 ثانیه از آنزیم.

07 تشخیص Multiplex Taq Polymerase

آنتی بادی‌های دوبار بسته Yeasen (Cat#31303) برای مهر و موم کردن سه نوع پلیمراز Taq (نوع وحشی + دو نوع جهش‌یافته)، با نسبت آب‌بندی 1μg به 5U استفاده شد و مقادیر فلورسانس و کارایی آب‌بندی اندازه‌گیری شد. مشخص شد که برای انواع مختلف پلیمرازهای Taq، آنتی‌بادی‌های دوبار بسته Yeasen (Cat#31303) اثرات آب‌بندی خوبی از خود نشان دادند.

جدول 2. راندمان مسدود شده انواع مختلف تاق پلیمراز.