با ادامه پیشرفت تحقیقات پزشکی، درمان هدفمند بالغ تر شده است. مقدمه درمان هدفمند انجام آزمایش ژنتیکی روی اهداف مولکولی داروها برای شناسایی جهش‌های ژنی است که باعث اختلالات ارثی یا بدخیمی‌ها می‌شود. ARMS-PCR یک روش جدید مبتنی بر PCR است که می تواند جهش های نقطه ای DNA متعددی را تشخیص دهد. در حال حاضر، یکی از ضروری ترین و گسترده ترین روش ها برای شناسایی ژنتیکی سفارشی سرطان ها است. فواید استفاده درمانی آن توسط متخصصان میدانی به خوبی تایید شده است.

1. PCR اختصاصی آلل چگونه کار می کند؟
2. چگونه می توان ویژگی ARMS را بهبود بخشید؟
3. محصولات ارائه شده توسط Yeasen چه ویژگی هایی دارند؟
4. داده های عملکرد محصول چیست؟
5. مردم چگونه محصولات را سفارش می دهند؟

1. PCR اختصاصی آلل چگونه کار می کند؟

ARMS-PCR یک سیستم PCR جهش مقاوم در برابر تقویت (ARMS-PCR) است که با نام آلل اختصاصی PCR (AS-PCR) نیز شناخته می شود. گسترش اختصاصی آلل برای شناسایی آلل نوع وحشی و ژن نوع وحشی جهش یافته تنظیم می شود و مقدار سیگنال فلورسانس با استفاده از تکنیک پروب Taqman اندازه گیری می شود.
پرایمرهای ARMS PCR با نوکلئوتیدهای مختلف در انتهای 3' دو پرایمر بالادست آلل طراحی شده اند و این دو پرایمر به ترتیب مخصوص نوع وحشی و نوع جهش یافته هستند. در طول تقویت، پرایمرهای بالادستی که به طور کامل با الگو مطابقت ندارند، قادر به تشکیل جفت های پایه مکمل نیستند، که منجر به عدم تطابق، توسعه مانع و ناتوانی در تولید محصولات PCR می شود، در حالی که سیستم های پرایمری که با الگو مطابقت دارند می توانند محصولات PCR مربوطه را تقویت کنند. فلوروفور موجود در کاوشگر Taqman ممکن است یک سیگنال فلورسنت منتشر کند که می تواند توسط دستگاه تشخیص داده شود و ژنوتیپ را می توان با ارزیابی داده های فلورسانس تأیید کرد.
فناوری ARMS حساسیت بالایی دارد، حد تشخیص می تواند به 100 کپی در میلی لیتر برسد و حد تشخیص بافت تومور می تواند به نرخ جهش 0.5٪ برسد. علاوه بر این، ARMS زمان‌بر و کم‌هزینه است و نتایج بصری و آسان برای قضاوت هستند. این به این دلیل است که ARMS همراه با qPCR یا فناوری الکتروفورز تنها به یک واکنش PCR نیاز دارد که زمان کمتری می‌برد. فقط پرایمرهای بالادست باید برای فناوری ARMS بهینه شوند، که در مقایسه با فناوری PCR بلادرنگ با استفاده از پروب های MGB، هزینه کمتر و نتایج بصری دارد. از آنجایی که بیشتر DNA استخراج شده از نمونه های بافت پارافینی تکه تکه شده است، نمی توان نتایج تشخیص دقیقی به دست آورد. روش ARMS برای به حداقل رساندن طول محصول هدف طراحی شده است، در نتیجه این مشکل در بافت پارافین تعبیه شده را برطرف می کند. در عین حال، ARMS همراه با پلت فرم PCR، عملیات لوله بسته را انجام می دهد، که کارکرد آن ساده است و نیازی به پس پردازش محصول ندارد، بنابراین از آلودگی محصولات تقویتی تا حد زیادی جلوگیری می کند.
از نظر تئوری، Taq DNA پلیمراز باید به طور کامل مکمل الگوی باقیمانده در انتهای 3' پرایمر باشد تا پلیمریزاسیون کارآمد انجام شود. با این حال، سختی DNA Taq تحت تأثیر عوامل متعددی است. در برخی موارد، حتی اگر پایه ترمینال 3' پرایمر مکمل الگو نباشد، یک پسوند می‌تواند ادامه یابد. اگر فقط یک عدم تطابق پایه در انتهای 3' وجود داشته باشد، پرایمرها را می توان ناهماهنگ و گسترش داد، اما راندمان گسترش کم است. دررفتگی های انتهایی 3' بازدهی متفاوتی دارند. اگر پایه‌های ناهماهنگ دیگری در انتهای 3' معرفی شوند، تعداد عدم تطابق‌ها بسیار زیاد است و انتهای 3' نمی‌تواند پس از یک سطح مشخص تمدید شود.بنابراین، تنها یک عدم تطابق پایه در انتهای 3' پرایمر نمی تواند به اندازه کافی دو آلل را متمایز کند و در نتیجه نتایج مثبت کاذب حاصل می شود.

2. چگونه می توان ویژگی ARMS را بهبود بخشید؟

تمرکز بهبود ویژگی ARMS بهبود ویژگی پسوند پرایمر است. یک پایه نامتناسب را می توان در پایه 2 یا 3 از انتهای 3' معرفی کرد. پایه های ناهماهنگ با پایه های ناهماهنگ در انتهای 3' عمل می کنند و در قالبی که مکمل انتهای 3' نیست، نرخ محصول تقویت پرایمر کاهش می یابد. در حالی که پرایمرها به طور معمول در قالب‌های مکمل انتهای 3' خود تقویت می‌شوند، نوع پایه‌های ناهماهنگ پرایمرها به نوع عدم تطابق پایه در انتهای 3' بستگی دارد.
پس از طراحی پرایمرهای خاص برای ARMS، یک جفت پروب TaqMan برای انتقال انرژی رزونانس فلورسانس خاص آلل مورد نیاز است. کاوشگر TaqMan دارای دو رنگ فلورسنت است، انتهای 5 یک ژن فلورسنت است و انتهای 3 دارای یک ژن خاموش کننده فلورسانس عمومی است. در یک کاوشگر کامل، ژن Quencher و ژن fluorogenic از نظر مکانی بسیار نزدیک به هم هستند و منجر به خاموش شدن فلورسانس می شود. در شرایط عادی، فلورسانس ساطع شده توسط فلوروفور در انتهای 5' قابل تشخیص نیست و فقط فلورسانس پس زمینه خاموش کننده در انتهای 3' قابل تشخیص است. در فرآیند تکثیر ژن هدف، هم پرایمرهای PCR و هم پروب های نشاندار شده با فلورسنت، در طول de-OR مکمل توالی هدف خواهند بود. هنگامی که آنزیم Taq هنگام گسترش رشته الگو با یک پروب متصل به الگو مواجه می شود، اگزونوکلئاز 5'-3' آنزیم Taq کاوشگر خاص متصل به الگو را تخریب می کند. فلوروفور روی کاوشگر با فضای فیزیکی از هم جدا می شود، اثر خاموش کننده ناپدید می شود و فلورسانس ساطع می شود. عدم تطابق بین پروب های فلورسنت ضعیف و توالی های هدف، میزان فلورسانس آزاد شده را کاهش می دهد.

شکل 1 مفهوم اساسی ARMS-PCR

3. محصولات ارائه شده توسط Yeasen چه ویژگی هایی دارند؟

YEASEN Hieff Unicon™ Multiplex ARMS qPCR Mix یک کیت مبتنی بر مفهوم بلوک تقویت است که امکان ژنوتیپ موثر با واسطه ARMS-PCR را فراهم می کند.

👍گزینش پذیری بالا: قادر به شناسایی چندین جهش ژنی است.
👍حساسیت بالا: آغازگرهای جهش یافته می توانند جهش ها را در غلظت های کمتر از 0.5٪ در 10ng/L DNA شناسایی کنند.
👍خواندن ساده: نتایج واضح است و به طور عینی ارزیابی شد و ساده و بدون پیچیدگی است
👍کارکرد ساده: با طیف وسیعی از تجهیزات PCR سازگار است، حالت عملکرد استاندارد شده است و تشخیص روی برد ممکن است در 90 دقیقه انجام شود.

4. داده های عملکرد محصول چیست؟

4.1 تاثیر انسداد محصول برتر

آزمایش: 5 لیتر ورودی الگو، 10 نانوگرم در لیتر الگوی نوع وحشی و مقادیر معادل پلاسمید جهش یافته با استفاده از پرایمرهای جهش یافته تکثیر شدند.
سایت: KRASG13D (38G>A)
قرمز：13755؛ آبی: رقبا

شکل 2 نشان می دهد که پرایمرهای نوع وحشی هر دو الگوی نوع وحشی و جهش یافته را تقویت می کنند. با توجه به منحنی تقویت، الگوی نوع وحشی هیچ پیکی ندارد یا تفاوت در مقدار Ct بین نوع وحشی و جهش یافته 6-8 است، که به ژن‌های نوع وحشی و جهش‌یافته اجازه می‌دهد به طور موثری متمایز شوند.

4.2 میزان تشخیص محصول می تواند به 0.05٪ برسد

آزمایش 1: تکنیک آماده سازی استاندارد خود اختلاط (50%): 50μL 10ng/μL DNA نوع وحشی و 50μL نسخه 3X103 از پلاسمید جهش یافته.
سایت：KRASG13D(38G>A)

شکل 3. با توجه به منحنی تقویت، محصول به طور موثر در غلظت 0.05٪ به کار خود ادامه می دهد.

آزمایش 2: استاندارد 5% خریداری شده (50ng/μL) با رقیق کننده کتابخانه به 10ng/μL رقیق شد، سپس با 10ng/μL 293g DNA به 0.1% و 0.05% رقیق شد.
سایت: L858R
قرمز：13755؛ آبی: رقبا

شکل 4: با توجه به منحنی تقویت، نرخ تشخیص جایگاه‌ها در برابر پس‌زمینه gDNA نوع وحشی 10ng/μL می‌تواند تا 0.05% باشد و اعتبارسنجی بعدی توسط استانداردهای تجاری نشان می‌دهد که محصولات ما دارای نرخ تشخیص عالی هستند.

4.3 پایداری عالی محصول

10 سیکل انجماد و ذوب بر اثرات تقویتی و مسدود کننده محصول تأثیری ندارد.
آزمایش: قرمز: -20℃؛ سبز: انجماد و ذوب واقعی 5 بار. آبی: انجماد و ذوب واقعی 8 بار. بنفش: انجماد و ذوب واقعی 10 بار.
سایت: L858R

شکل 5 نشان می دهد که انجماد و ذوب مکرر معرف 13755 ده بار تأثیری بر خواص تقویتی و مسدود کنندگی آن ندارد.

اثرات تقویتی و مسدود کننده آن در دمای 37 درجه سانتیگراد به مدت 7 روز بی تاثیر است.
آزمایش: قرمز: -20 درجه سانتیگراد. سبز و بنفش: 37 درجه سانتیگراد به مدت 7 روز.
سایت: L858R

شکل 6 نشان می دهد که هفت روز در دمای 37 درجه سانتی گراد هیچ تاثیری بر تقویت و عملکرد مسدود کننده معرف 13755 ندارد.

5. مردم چگونه محصولات را سفارش می دهند؟

Yeasen Biotechnology (Shanghai) Co., Ltd. که در سال 2014 تأسیس شد، یک شرکت با فناوری پیشرفته است که در تحقیق و توسعه و تولید مواد خام آنزیم ابزار و آنتی بادی های آنتی ژن مشغول است. محصولات آن شامل آنزیم های تشخیصی مولکولی، پروتئین ها و آنتی بادی های مورد استفاده در داروسازی، آزمایش ایمنی مواد غذایی، اصلاح نژاد، دادگستری و سایر صنایع است. ما متعهد به ارائه محصولات و خدمات با کیفیت به مشتریان در زمینه علوم زیستی هستیم. محصولاتی که Yeasen می تواند ارائه دهد به شرح زیر است:

جدول 1: محصولات ارائه شده توسط Yeasen