مقدار Ct یک نمایش پیامد مهم در PCR کمی فلورسنت است. برای محاسبه تفاوت در سطوح بیان ژن یا تعداد کپی ژن استفاده می شود. بنابراین، چه محدوده ای از مقادیر Ct را می توان در کمیت فلورسنت معقول در نظر گرفت؟ چگونه می توانیم اطمینان حاصل کنیم که مقادیر Ct در یک محدوده موثر قرار می گیرند؟ امروز اجازه دهید شیائو یی به این سوال برای همه پاسخ دهد.
مقدار Ct چیست؟
در فرآیند تقویت qPCR، مقدار Ct به تعداد سیکل های تقویت (Cycle Threshold) اشاره دارد که در آن سیگنال فلورسانس محصول تقویت شده به آستانه فلورسانس تنظیم شده می رسد. "C" مخفف Cycle و "T" مخفف Threshold است. به زبان ساده، مقدار Ct تعداد چرخه‌هایی است که طول می‌کشد تا الگوی شروع در qPCR به مقدار مشخصی محصول برسد که بعداً توضیح داده خواهد شد.
تابع مقدار Ct چیست؟
1. رابطه بین تقویت نمایی، کمیت الگو و مقدار Ct
در یک سناریوی ایده‌آل، در طول qPCR، ژن‌ها به صورت تصاعدی تقویت می‌شوند و در تعداد معینی از چرخه‌ها تجمع می‌یابند. رابطه بین تعداد چرخه های تقویت و مقدار محصول را می توان به صورت زیر بیان کرد: مقدار محصول تقویت شده = مقدار اولیه الگو×(1 + En)^ تعداد چرخه ها. با این حال، واکنش های qPCR همیشه در شرایط ایده آل رخ نمی دهد. هنگامی که مقدار محصول تقویت شده به یک "مقدار محصول معین" می رسد، تعداد چرخه ها در این نقطه مقدار Ct است که دوره تقویت نمایی را نشان می دهد. رابطه بین مقدار Ct و مقدار اولیه الگو به شرح زیر است: یک رابطه خطی بین مقدار Ct یک الگو و لگاریتم شماره کپی اولیه آن الگو وجود دارد. غلظت بالاتر الگوی اولیه منجر به مقدار Ct کمتر می شود، در حالی که غلظت کمتر الگوی اولیه منجر به مقدار Ct بالاتر می شود.
2. منحنی تقویت، آستانه فلورسانس، و یک مقدار محصول خاص
مقدار محصولات تقویت qPCR مستقیماً به شکل سیگنال های فلورسانس نشان داده می شود که به عنوان منحنی تقویت شناخته می شود. در مراحل اولیه PCR، زمانی که تقویت تحت شرایط ایده آل است و تعداد سیکل ها کم است، تجمع محصولات حداقل است و سطح فلورسانس تولید شده به طور قابل توجهی از نویز فلورسانس پس زمینه قابل تشخیص نیست. متعاقباً تولید فلورسانس وارد فاز نمایی می شود. مقدار محصول PCR را می توان در یک نقطه مشخص، زمانی که واکنش تازه وارد فاز نمایی می شود، تشخیص داد که به آن "مقدار محصول معین" می گویند. از این می توان برای استنباط محتوای اولیه الگو استفاده کرد. بنابراین، شدت سیگنال فلورسانس مربوط به مقدار محصول خاص به عنوان آستانه فلورسانس شناخته می شود.
در مراحل بعدی PCR، منحنی تقویت دیگر تقویت نمایی را نشان نمی دهد و وارد فاز خطی و فاز فلات می شود.
3. تکرارپذیری مقادیر Ct
وقتی چرخه‌های PCR به تعداد سیکل‌هایی می‌رسند که در آن مقدار Ct رخ می‌دهد، تازه وارد فاز تقویت نمایی واقعی می‌شود. در این مرحله، خطاهای جزئی تقویت نشده اند، بنابراین تکرارپذیری مقادیر Ct عالی است. این بدان معنی است که چه یک الگو در زمان های مختلف تقویت شود و چه در لوله های مختلف به طور همزمان، مقادیر Ct بدست آمده ثابت می ماند.
محدوده مقادیر Ct چقدر است؟
1. راندمان تقویت En
کارایی تقویت PCR به کارایی اطلاق می شود که پلیمراز با آن ژن هدف را به محصولات تقویتی تبدیل می کند.وقتی یک مولکول DNA به دو مولکول DNA تبدیل شود، بازده تقویت 100٪ است. راندمان تقویت معمولاً به عنوان En نشان داده می شود. برای سهولت تجزیه و تحلیل در مقالات بعدی، در اینجا به معرفی مختصری از عوامل موثر بر راندمان تقویت می پردازیم.
| عوامل تأثیرگذار | توضیح | قضاوت ها |
| A. مهارکننده های PCR | 1. RNA الگو ممکن است حاوی موادی باشد که واکنش PCR را مهار می‌کنند، مانند پروتئین‌ها یا مواد شوینده. 2. cDNA به دست آمده پس از رونویسی معکوس ممکن است حاوی غلظت بالایی از RNA الگو و اجزای معرف های رونویسی معکوس باشد که می تواند PCR بعدی را نیز مهار کند. | 1. وجود آلودگی را می توان با اندازه گیری نسبت های A260/A280 و A260/A230 یا با انجام الکتروفورز RNA ارزیابی کرد. 2. پس از رونویسی معکوس، آیا cDNA به نسبت معینی رقیق شده است یا خیر. |
| ب- طراحی پرایمر غیر منطقی | پرایمر نمی تواند به طور موثر بازپخت شود. | بررسی کنید که آیا ساختارهای دایمر یا سنجاق سر در پرایمرها وجود دارد یا خیر، و آیا ناهماهنگی وجود دارد. گاهی اوقات لازم است به اینترون های پوششی طراحی توجه شود. |
| ج-روش واکنش نامناسب | 1. پرایمرها نمی توانند به طور موثر بازپخت شوند. 2. فعالیت DNA پلیمراز به طور کامل آزاد نمی شود. 3. به دلیل دماهای بالا طولانی مدت، فعالیت DNA پلیمراز کاهش می یابد. | 1. دمای بازپخت بالاتر از مقدار Tm پرایمر است. 2. زمان قبل از دناتوراسیون خیلی کوتاه است. 3. مدت زمان هر مرحله در پروتکل واکنش خیلی طولانی است. |
| D. معرف ها کاملاً مخلوط نشده اند یا خطاهای پیپتینگ | در سیستم واکنش، غلظت موضعی اجزای واکنش PCR خیلی زیاد یا ناهموار است که منجر به تقویت غیر نمایی PCR می شود. | / |
| طول آمپلیکون E | طول آمپلیکون بیش از حد طولانی است، بیش از 300 جفت پایه، و در نتیجه راندمان تقویت پایین است. | بررسی کنید که آیا طول آمپلیکون بین 80 جفت پایه و 300 جفت پایه باشد. |
| F. تاثیر معرف های qPCR | غلظت کمتر DNA پلیمراز در معرف ها یا غلظت یون های کمتر از حد مطلوب در بافر باعث می شود آنزیم Taq به حداکثر فعالیت خود نرسد. | منحنی استاندارد برای اندازه گیری راندمان تقویت پرایمرها استفاده می شود. |
2. محدوده مقادیر Ct
محدوده مقادیر Ct 15-35 است. مقدار Ct کمتر از 15 در فاز پایه در نظر گرفته می شود و به آستانه فلورسانس نرسیده است. در حالت ایده آل، یک رابطه خطی بین مقدار Ct و لگاریتم شماره کپی اولیه الگو وجود دارد که به عنوان منحنی استاندارد شناخته می شود. با استفاده از منحنی استاندارد، زمانی که راندمان تقویت 100% باشد، مقدار Ct برای کمی کردن یک نسخه از ژن حدود 35 محاسبه می شود. اگر مقدار Ct بیشتر از 35 باشد، از نظر تئوری، تعداد کپی اولیه الگو کمتر از 1 است که می تواند از نظر آماری ناچیز در نظر گرفته شود.
برای ژن‌های مختلف، محدوده مقدار Ct، به دلیل تغییرات در مقدار الگوی اولیه نسخه‌های ژن و کارایی تقویت، نیاز به ایجاد یک منحنی استاندارد برای آن ژن برای محاسبه محدوده تشخیص خطی ژن دارد.
3.عوامل موثر بر مقادیر Ct
همانطور که با رابطه بین تعداد چرخه های تقویت و مقدار محصول مشخص می شود: مقدار محصول تقویت = مقدار اولیه الگو × (1 + En)^ تعداد چرخه ها، می توان مشاهده کرد که در شرایط ایده آل، مقدار قالب اولیه و En بر مقدار Ct تأثیر می گذارد. تفاوت در کیفیت قالب یا راندمان تقویت می تواند باعث شود که مقدار Ct خیلی زیاد یا خیلی پایین باشد.
4. مقادیر Ct خیلی زیاد یا خیلی کم است
شیائو یی با کارشناسان بخش فنی شرکت ما مشورت کرد و دلایل و راه حل های دو نوع مشکل رایج با مقادیر Ct را خلاصه کرد تا خوانندگان ما را روشن کند.
| مشکل | علل | راه حل ها |
| مقدار CT خیلی بالاست | غلظت الگو کم است یا مهارکننده های PCR وجود دارد. راندمان تقویت پایین است. | 1. غلظت قالب را افزایش دهید. یا افزایش نسبت رقت RNA یا cDNA. یا دوباره قالب را آماده کنید. 2. دمای بازپخت را کاهش دهید یا از روش تقویت دو مرحله ای استفاده کنید. اطمینان حاصل کنید که اجزا و سیستم کاملاً مخلوط شده اند. بهینه سازی پروتکل واکنش؛ یا سعی کنید معرف ها را جایگزین کنید. |
| مقدار CT خیلی کم است | 1. غلظت قالب بالا 2. آلودگی در NTC (بدون کنترل الگو) و NRC (بدون کنترل معکوس) 3. طراحی پرایمر نامناسب | 1. مقدار RNA الگو را کاهش دهید. یا cDNA را با نسبت بالاتر رقیق کنید. 2. همه معرف ها را دوباره جایگزین کنید. یا از معرف های ضد آلودگی UDGase استفاده کنید. 3. روش را برای جلوگیری از تقویت غیر اختصاصی بهینه کنید. |
این تجزیه و تحلیل علل غیرطبیعی Ct را برای این موضوع به پایان می‌رساند. در مرحله بعد، شیائو یی طیفی از محصولات مقرون به صرفه را توصیه می کند تا اطمینان حاصل شود که داده های آزمایشی شما دقیق تر و قابل اعتمادتر هستند. بیا و موارد دلخواه خود را انتخاب کن!
| نام محصول | گربه# | اندازه |
| Hieff UNICON™ Universal Blue qPCR SYBR Green Master Mix | 11184ES08 | 5×1 میلی لیتر |
| Hifair™ Ⅲ 1st Strand cDNA Synthesis SuperMix for qPCR (gDNA digester plus) | 11141ES60 | 100 ت |
| Hifair™ AdvanceFast One-step RT-gDNA Digestion SuperMix for qPCR | 11151ES60 | 100 ت |
| کیت سنتز cDNA رشته اول Hifair AdvanceFast (بدون رنگ) | 11150ES60 | 100 ت |