مجتمع را ساده کنید! بگذارید شما را از طریق تجزیه و تحلیل داده های qPCR با سهولت راهنمایی کنم

فلورسنت کمی PCR (qPCR) یک تکنیک رایج در آزمایشگاه ها است که می تواند برای تجزیه و تحلیل بیان ژن، ژنوتیپ، تشخیص پاتوژن، تجزیه و تحلیل SNP و غیره استفاده شود. عملکرد qPCR ساده است و درک اصل آن آسان است. اکنون، در مواجهه با انبوهی از داده های آشفته، نحوه تجزیه و تحلیل نتایج به یک کار دلهره آور تبدیل می شود. امروز، شیائو یی شما را راهنمایی می کند که چگونه فرآیندهای پیچیده را ساده کنید و به راحتی داده هایی را به دست آورید که می توانند در مجلات SCI منتشر شوند!

روش های رایج تجزیه و تحلیل مورد استفاده در qPCR شامل کمی سازی نسبی و کمی سازی مطلق است و انتخاب بین این روش ها باید بر اساس طرح های تجربی مختلف باشد. در این شماره، ما بر روی یک کاربرد رایج از تجزیه و تحلیل بیان ژن qPCR تمرکز خواهیم کرد، که در آن روش کمی نسبی به طور کلی انتخاب شده است.

طراحی تجربی

فرض کنید در حال حاضر نیاز به مطالعه اثر القای نور بر بیان ژن Arabidopsis AtSUC2 داریم. گروه شاهد شامل گیاهان آرابیدوپسیس است که تحت هیچ گونه تیماری قرار نگرفته اند، در حالی که گروه آزمایش، گیاهانی هستند که با القای نور خاصی تیمار شده اند. RNA از هر دو گروه استخراج می‌شود و برای به دست آوردن cDNA، رونویسی معکوس می‌شود، که سپس به عنوان یک الگو استفاده می‌شود. ژن Arabidopsis GAPDH به عنوان مرجع داخلی برای آزمایش qPCR انتخاب خواهد شد.

چاه های qPCR که باید راه اندازی شوند به شرح زیر است:

1) NTC (بدون کنترل الگو) برای بررسی وجود آلودگی در سیستم PCR استفاده می شود.

2) NRT (بدون رونویسی معکوس) به استفاده از RNAی که رونویسی معکوس انجام نداده است به عنوان الگو اشاره دارد که به عنوان کنترلی برای آلودگی gDNA عمل می کند.

3) ژن مرجع داخلی برای اصلاح تفاوت های ناشی از غلظت های اولیه متفاوت نمونه ها استفاده می شود.

4) انتخاب نمونه های کنترل به طور کلی در دسته های زیر قرار می گیرد:

1. برای ارزیابی اثر یک درمان خاص بر بیان ژن، نمونه تیمار نشده به عنوان نمونه مرجع استفاده می شود.
2. برای تشخیص تفاوت در بیان ژن در زمان های مختلف، نمونه در زمان 0 به عنوان نمونه مرجع استفاده می شود.
3. برای مقایسه تفاوت‌های بیان ژن در بین بافت‌های مختلف، یک بافت به‌طور خودسرانه به عنوان نمونه مرجع انتخاب می‌شود.

نکته ای که در اینجا باید به آن توجه کرد این است که برای هر ماده ذکر شده در بالا، 3 چاه PCR (1، 2، 3) راه اندازی شده است. اینها نسخه های تکراری PCR هستند که به عنوان تکرارهای فنی نیز شناخته می شوند، برای حذف خطاهای عملیاتی و ارزیابی دقیق بازده تقویت هستند. علاوه بر این، تکرارهای بیولوژیکی باید ایجاد شوند، که شامل انجام یک آزمایش مشابه بر روی مواد مختلف (زمان‌های مختلف، گیاهان، دسته‌ها، صفحات واکنش) برای کالیبره کردن تنوع بیولوژیکی و تجزیه و تحلیل اینکه آیا تیمار دارای اهمیت آماری است یا خیر. به طور خاص در این مورد، هم گروه آزمایش و هم گروه کنترل نیاز به پردازش حداقل دو مجموعه دیگر از نمونه های آرابیدوپسیس (A, B, C) دارند. RNA از هر مجموعه استخراج می شود و رونویسی معکوس انجام می شود و به دنبال آن qPCR انجام می شود. برای تجزیه و تحلیل آماری از میانگین سه تکرار بیولوژیکی استفاده می شود.

تجزیه و تحلیل نتایج - روش ΔΔCt

ویژگی روش ΔΔCt این است که برای محاسبه صرفاً بر مقادیر Ct متکی است، اما فرض این است که راندمان تقویت ژن هدف و ژن مرجع باید نسبتاً سازگار باشد و هر دو در محدوده 90-110٪ قرار گیرند.

فرمول محاسبه خاص به شرح زیر است:

ΔCt = Ct (ژن هدف) - Ct (ژن مرجع)

ΔΔCt = ΔCt (گروه تجربی) - ΔCt (گروه کنترل)

RQ = 2^(-ΔΔCt)

با فرض آزمایش فوق در مورد مطالعه اثر القای نور بر بیان ژن Arabidopsis AtSUC2، نتایج qPCR به شرح زیر است:

در طول محاسبه، ابتدا میانگین داده های 2^-△Ct را برای گروه کنترل محاسبه می کنیم (همانطور که در شکل بالا نشان داده شده است که 0.00116 است). سپس هر مقدار 2^-△Ct را بر این میانگین تقسیم می کنیم تا مقدار 2^-△△Ct به دست آید. در نهایت، ما این مقادیر را برای به دست آوردن میانگین و انحراف معیار سازماندهی می کنیم، که نشان می دهد سطح بیان ژن هدف در گروه آزمایش تقریباً 73/9 برابر نسبت به گروه کنترل افزایش یافته است.

نتایج با استفاده از نرم افزار Graphpad به شرح زیر رسم شده است:

مقدار P محاسبه شده با استفاده از آزمون t نرم افزار 0.0024 است که کمتر از 0.05 است که نشان دهنده تفاوت آماری معنی دار و نتایج قابل اعتماد است.

تجزیه و تحلیل نتایج - روش منحنی استاندارد دوگانه

در کاربردهای عملی، از آنجایی که بازده تکثیر ژن هدف و ژن مرجع اغلب متفاوت است، طراحی مجدد پرایمرها و بهینه سازی شرایط واکنش برای دستیابی به راندمان تقویت یکسان ضروری است. با این حال، ما همچنین می توانیم یک روش راحت تر، رویکرد منحنی استاندارد دوگانه را انتخاب کنیم.

در اینجا، اجازه دهید ابتدا روش تحلیل کمیت مطلق را درک کنیم. مراحل خاص عبارت است از تکثیر قطعه هدف از طریق PCR، سپس وارد کردن قطعه هدف در یک وکتور شبیه سازی، استخراج پلاسمید نوترکیب و پس از تایید توالی یابی، می توان از آن به عنوان استاندارد استفاده کرد. مقدار DNA پلاسمید را می توان با استفاده از ابزارهایی مانند Nanodrop اندازه گیری کرد و تعداد کپی با استفاده از فرمول تبدیل شماره کپی به نسخه های پلاسمید خاصی تبدیل می شود. پس از آن، DNA به دنبال یک سری رقت ها تکثیر می شود. یک منحنی استاندارد با لگاریتم عدد کپی استاندارد به عنوان محور x و مقادیر Ct اندازه گیری شده به عنوان محور y رسم می شود. بر اساس مقدار Ct نمونه مجهول می توان عدد کپی مطلق آن را محاسبه کرد.

فرمول محاسبه عدد کپی:

عدد کپی = (جرم ÷ جرم مولکولی نسبی) × 6.02 × 10^23

روش منحنی استاندارد دوگانه شامل ساخت جداگانه نمونه های استاندارد برای ژن هدف و ژن مرجع، انجام کمی سازی مطلق و ایجاد منحنی های استاندارد است. پس از محاسبه تعداد کپی مطلق نمونه های ناشناخته، مقایسه ای انجام می شود و در نتیجه دقت بالاتری ارائه می شود.

فرمول محاسبه خاص به شرح زیر است:

Q = تعداد نسخه های ژن هدف / تعداد نسخه های ژن مرجع

RQ = Q (تجربی) / Q (کنترل)

در آزمایشی که در بالا ذکر شد، که به بررسی اثر القای نور بر بیان ژن Arabidopsis AtSUC2 می‌پردازد، نمونه‌های استاندارد برای AtSUC2 و GAPDH ساخته شد و منحنی‌های استاندارد زیر تهیه شد:

مقادیر Ct برای ژن هدف و ژن مرجع داخلی در نمونه های مورد آزمایش به شرح زیر است:

در طول محاسبه، ابتدا مقادیر Ct ژن هدف و ژن مرجع داخلی در رابطه خطی منحنی استاندارد جایگزین می‌شوند تا اعداد کپی مطلق ژن هدف و ژن مرجع داخلی در هر دو گروه آزمایش و کنترل به دست آید. سپس با استفاده از فرمول Q = تعداد نسخه های ژن هدف / تعداد نسخه های ژن مرجع، سطح بیان ژن هدف نرمال می شود.در نهایت، با توجه به فرمول RQ = Q (تجربی) / Q (شاهد)، RQ 9.71 محاسبه می شود که نشان می دهد سطح بیان ژن هدف در گروه آزمایش 9.71 برابر بیشتر از گروه کنترل است.

نتایج با استفاده از نرم افزار GraphPad به شرح زیر رسم شده است:

مقدار P محاسبه شده با استفاده از آزمون t نرم افزار 0.0008 است که کمتر از 0.05 است که نشان دهنده تفاوت آماری معنی دار و نتایج قابل اعتماد است.

که تجزیه و تحلیل داده های qPCR برای این جلسه را به پایان می رساند. در مرحله بعد، من طیفی از محصولات مقرون به صرفه را توصیه می کنم تا اطمینان حاصل شود که داده های آزمایشی شما دقیق تر و قابل اعتمادتر هستند. بیا و آنها را بردار!

نام محصول	گربه#	اندازه
Hieff UNICON™ Universal Blue qPCR SYBR Green Master Mix	11184ES08	5×1 میلی لیتر
Hifair™ Ⅲ 1st Strand cDNA Synthesis SuperMix for qPCR (gDNA digester plus)	11141ES60	100 ت
Hifair™ AdvanceFast One-step RT-gDNA Digestion SuperMix for qPCR	11151ES60	100 ت
کیت سنتز cDNA رشته اول Hifair AdvanceFast (بدون رنگ)	11150ES60	100 ت