طول miRNA بالغ تنها حدود 20nt است، معمولاً پرایمر جلو تمام طول آن را می پوشاند یا حتی یک قسمت اضافی دارد و پرایمر معکوس جایی برای قرار دادن نخواهد داشت. راه حل فعلی بازار افزایش طول رونوشت معکوس در طول رونویسی معکوس است. روش های رایج شامل روش باطله و روش حلقه ساقه است.

1. مقدمه
2. محصولات توصیه شده
3. لیست محصولات مرتبط

1. مقدمه

MicroRNA ها (miRNAs) RNA های کوچک تک رشته ای با اندازه حدود 21-23 باز هستند که از پیش سازهای RNA تک رشته ای با ساختار سنجاق سر حدود 70-90 باز پس از پردازش آنزیم دایسر تولید می شوند. miRNA عمدتاً به‌طور خاص به ناحیه غیر کدکننده 3' mRNA ژن هدف متصل می‌شود و فرآیند ترجمه mRNA ژن هدف پس از رونویسی را تنظیم می‌کند، در نتیجه ترجمه mRNA را مسدود می‌کند و باعث تخریب mRNA می‌شود و در نتیجه بیان پروتئین کاهش می‌یابد. نقش miRNA ها در بروز و توسعه بیماری های قلبی عروقی مختلف مانند آنتوژنز، تمایز بافتی، تکثیر سلولی و آپوپتوز نقش دارد.

شکل 1. نمودار شماتیک سنتز miRNA در داخل بدن

طول miRNA بالغ تنها حدود 20nt است، معمولاً پرایمر جلو تمام طول آن را می پوشاند یا حتی یک قسمت اضافی دارد و پرایمر معکوس جایی برای قرار دادن نخواهد داشت. راه حل فعلی بازار افزایش طول رونوشت معکوس در طول رونویسی معکوس است. روش های رایج شامل روش باطله و روش حلقه ساقه است.

شکل 2. سنتز miRNA به روش tailing

شکل 3. سنتز miRNA به روش حلقه ساقه

روش باطله سازی از پلیمراز PolyA برای افزودن دم Poly(A) به miRNA بالغ استفاده می کند و از Oligo-dT با توالی جهانی به عنوان آغازگر رونویسی معکوس برای سنتز miRNA بلند شده مربوط به اولین رشته cDNA استفاده می کند. روش حلقه ساقه از توالی جهانی تا شده در ساختار حلقه ساقه به عنوان آغازگر برای سنتز اولین رشته cDNA مربوط به miRNA دراز استفاده می کند. ساختار ساقه-حلقه در طی فرآیند تقویت بعدی در دمای مناسب باز می شود و با پرایمرهای تقویت مربوطه ترکیب شود.

جدول 1.مقایسه باطله و حلقه ساقه

2. محصولات توصیه شده

2.1 ترکیب کمی وارونگی دم miRNA Yeasen (11148ES&11171ES)

شکل 4. کیت سنتز cDNA 1st Strand miRNA 11148ES-Hifair™

این کیت از روش باطله برای معکوس کردن رونویسی cDNA رشته اول miRNA استفاده می کند. بافر RT miRNA 2×Hifair در محصول حاوی تمام مواد خام و آغازگرهای واکنش باطله miRNA و واکنش رونویسی معکوس است و به دقت بهینه شده است. می تواند اطمینان حاصل کند که فرآیندهای اصلاح poly(A) و رونویسی معکوس انتهای miRNA 3 به طور همزمان به طور موثر انجام می شود.

شکل 5. 11171ES -Hieff™ miRNA Universal qPCR SYBR Master Mix

نسل جدیدی از معرف‌های تشخیص کمی فلورسانس PCR از پیش مخلوط شده که مخصوص تشخیص کمی miRNA هستند، حاوی رنگ مرجع غیرفعال ROX ویژه، مناسب برای تمام ابزارهای qPCR، بدون نیاز به تنظیم غلظت ROX در ابزارهای مختلف، فقط در واکنش آماده‌سازی می‌توان با افزودن پرایمرها و قالب‌ها، تقویت را با افزودن پرایمرها و قالب‌ها انجام داد. DNA پلیمراز از پلیمراز شروع گرم اصلاح شده شیمیایی استفاده می کند و با یک سیستم بافر ویژه همکاری می کند که ویژگی و حساسیت واکنش را بالاتر می برد و می تواند با دقت در محدوده وسیع تری کمیت کند.

2.2 عملکرد محصول

2.2.1 سازگار با ابزارهای qPCR تمام پلتفرم

شکل 6. نتایج سازگار با ابزارهای مختلف qPCR

با استفاده از RNA کل سلول های 293T به عنوان یک الگو، رونویسی معکوس با کیت سنتز cDNA رشته 1 Hifair miRNA (Cat# 11148ES) انجام شد.cDNA به دست آمده 10 برابر رقیق شد و سپس از Hieff™ miRNA Universal qPCR SYBR Master Mix (Cat# 11171ES) برای شناسایی ژن های مرجع داخلی hsa-miR-let-7b-5p، hsa-miR-let-7c-5p و U6 استفاده شد.

2.2.2 نرخ تشخیص بالا، تا 10 pg

شکل 7. نمودار تقویت

شکل 8. نمودار تقویت

با استفاده از hsa-miR-let-7e-5p(a) مصنوعی و سلول 293T Total RNA(b) به‌عنوان الگو، رقیق‌شده به ترتیب به شیب‌های زیر: 60 کپی تا 606 کپی (6 گرادیان) و 10 pg-100 نانوگرم (5 شیب ™ NA، 100 ng) کیت سنتز (Cat# 11148ES)، و cDNA حاصل با Hieff™ miRNA Universal qPCR SYBR Master Mix (Cat# 11171ES) برای بیان ژن hsa-miR-let-7e -5p شناسایی شد.

2.2.3 ویژگی بالا، قادر به تشخیص تفاوت های پایه منفرد بین miRNA ها در یک خانواده است

شکل 9. تفاوت های تک پایه بین miRNA ها را تشخیص دهید

خانواده hsa-let-7 انسان دارای چندین miRNA است، با تعداد کمی از پایه‌هایی که با یکدیگر متفاوت هستند یا حتی تنها یک تفاوت پایه دارند. miRNA های مصنوعی برای هر ایزوفرم Let-7 (hsa-miR-let-7a~Let-7i، has-miR-98) با استفاده از کیت سنتز cDNA رشته 1 Hifair miRNA به cDNA رونویسی معکوس شدند (Cat# 11148ES)، با استفاده از Hieff Master™P MiRNAYSR 11171ES) برای تقویت این miRNA ها به طور جداگانه با آغازگرهای مختلف، و محاسبه نرخ تطابق با استفاده از معادله 2-ΔCT x 100%. نتایج نشان می‌دهد که اعضای خانواده زیرگروه نزدیک به هم را می‌توان به طور موثر متمایز کرد.

2.2.4 راندمان تقویت عالی

شکل 10. راندمان تقویت

شکل 11. راندمان تقویت

ژن‌های miR-let-7b-5p، miR-let-7c-5p، miR-let-7e-5p، miR-let-7f-5p با استفاده از سلول‌های 293T انسانی و RNA توتال کبد موش به عنوان الگو تکثیر شدند. نتایج نشان داد که در مقایسه با محصولات مشابه، کیت سنتز cDNA رشته 1 Hifair miRNA (Cat# 11148ES) با سیستم واکنش Hieff™ miRNA Universal qPCR SYBR Master Mix (Cat# 11171ES) با عملکرد عالی مطابقت دارد.

2.2.5 پایداری عالی

شکل 12. تجزیه و تحلیل پایداری محصول در دمای 37 درجه سانتیگراد به مدت 7 روز

شکل 13. تجزیه و تحلیل نتایج پس از 50 چرخه انجماد و ذوب

شکل 14. خواص تحلیلی پایدار سیستم واکنش کمی در دماهای مختلف به مدت 24 ساعت

رونویسی معکوس با Hifair ™ miRNA 1st Strand cDNA Synthesis Kit (Cat# 11148ES) با استفاده از 293T سلول RNA به عنوان الگو انجام شد، و cDNA به دست آمده 10 برابر رقیق شد و با Hieff™ miRNA Universal qPCR SYBR Master Mix (#111at) شناسایی شد. بیان hsa-miR-let-7b-5p، hsa-miR-let-7c-5p، hsa-miR-let-7e-5p. △CT<0.5.

2.3 ترکیب کمی وارونگی ساقه-حلقه miRNA Yeasen (11139ES&11170ES)

شکل 15. کیت سنتز cDNA رشته اول 11139ES-Hifair™ III (gDNA digester plus)

این کیت بر اساس Hifair™ III Reverse Transcriptase ساخته شده است.سرعت سنتز آنزیم cDNA سریع است و پایداری حرارتی تا حد زیادی بهبود یافته است. در عین حال، آنزیم میل ترکیبی را با الگو افزایش می دهد و برای رونویسی معکوس تعداد کمی از الگوها و ژن های کم کپی مناسب است. توانایی Hifair™ III Reverse Transcriptase برای سنتز cDNA تمام قد نیز بهبود یافته است و امکان سنتز cDNA تا 19.8 کیلوبایت را فراهم می کند.

شکل 16. 11170ES-Hieff™ miRNA Universal qPCR SYBR Master Mix

این محصول یک ترکیب اصلی ویژه برای تعیین کمیت miRNA با استفاده از روش فلورسانس کایمریک SYBR Green I است. از آنجایی که توالی‌های miRNA کوتاه هستند و توالی‌های miRNA در یک خانواده اغلب بسیار مشابه هستند، ویژگی در طول کمی‌سازی بسیار مورد نیاز است. این محصول مبتنی بر DNA پلیمراز شروع داغ، با بافر بهینه شده است که می تواند تا حد زیادی تقویت غیر اختصاصی را کاهش دهد. در عین حال، رنگ مرجع ویژه ROX باعث می شود میکس اصلی برای تمام ابزارهای qPCR مناسب باشد و نیازی به تنظیم ROX بر روی ابزارهای مختلف نیست. تقویت را می توان با افزودن پرایمرها و قالب ها هنگام تهیه سیستم واکنش انجام داد.

2.3.1 سازگار با ابزارهای qPCR تمام پلتفرم

شکل 17. نتایج سازگار با ابزارهای مختلف qPCR

با استفاده از RNA کل سلول های کبد موش به عنوان یک الگو، رونویسی معکوس با Hifair™ III 1st Strand انجام شد.
کیت سنتز cDNA (gDNA digester plus) (Cat# 11139ES)، و cDNA بدست آمده 40 برابر رقیق شد و از Hieff™ miRNA Universal qPCR SYBR Master Mix (Cat# 11170ES) برای تقویت ژن mmu-miR-125a انسانی استفاده شد.

2.3.2 حساسیت بالا، تا 10 pg

شکل 18. تشخیص حساسیت

با استفاده از RNA کل سلول‌های کبد موش به عنوان الگو، رونویسی معکوس با کیت سنتز cDNA رشته اول Hifair™ III (gDNA digester plus) (Cat# 11139ES) انجام شد و cDNA به‌دست‌آمده به‌صورت سریالی 10 برابر (محدوده 10 pg/μL) رقیق شد. -0.1 میکروگرم بر میکرولیتر)، ژن‌های mmu-miR-125a، mmu-miR-132 و mmu-miR-351 با منشاء موشی را تقویت می‌کنند.

2.3.3 ویژگی بالا، قادر به تشخیص تفاوت های پایه منفرد بین miRNA ها در یک خانواده است

شکل 19. تفاوت های تک پایه بین miRNA ها را تشخیص دهید

خانواده hsa-let-7 انسان دارای چندین miRNA است، با تعداد کمی از پایه‌هایی که با یکدیگر متفاوت هستند یا حتی تنها یک تفاوت پایه دارند. این miRNA ها به طور جداگانه با پرایمرهای مختلف با استفاده از Hieff™ miRNA Universal qPCR SYBR Master Mix (Cat# 11170ES) تکثیر شدند و میزان تطابق با استفاده از فرمول 2^-Δct x 100 درصد محاسبه شد.

2.3.4 تکرارپذیری خوب

شکل 20. تشخیص تکرارپذیری

با استفاده از RNA کل سلول‌های 293T انسانی به‌عنوان الگویی برای رونویسی معکوس، رونویسی معکوس با کیت سنتز cDNA رشته اول Hifair™ III (gDNA digester plus) (Cat# 11139ES) انجام شد و cDNA به‌دست‌آمده 50 برابر رقیق شد (QRNA ™ Universatxe Hifair S 11170ES) برای تکثیر ژن hsa-let-7a انسانی در یک آزمایش تکراری 90 چاهی استفاده شد.

2.3.5 پایداری خوب

شکل 21.تجزیه و تحلیل پایداری 11170ES در دماهای مختلف به مدت 14 روز

شکل 22. تجزیه و تحلیل انجماد و ذوب مکرر 11170ES

شکل 23. خواص تجزیه و تحلیل پایدار سیستم واکنش کمی در دماهای مختلف به مدت 24 ساعت

RNA کل سلول های کبد موش به عنوان الگویی برای رونویسی معکوس با کیت سنتز cDNA رشته اول Hifair™ III (gDNA digester plus) (Cat# 11139ES) استفاده شد. cDNA بدست آمده 100 برابر رقیق شد تا ژن mmumiR-132 موش را تقویت کند.

3. لیست محصولات مرتبط

Yeasen Biotechnology (Shanghai) Co., Ltd. که در سال 2014 تأسیس شد، یک شرکت با فناوری پیشرفته است که در تحقیق و توسعه و تولید مواد خام آنزیم ابزار و آنتی بادی های آنتی ژن مشغول است. محصولات آن شامل آنزیم های تشخیصی مولکولی، پروتئین ها و آنتی بادی های مورد استفاده در داروسازی، آزمایش ایمنی مواد غذایی، اصلاح نژاد، دادگستری و سایر صنایع است. ما متعهد به ارائه محصولات و خدمات با کیفیت به مشتریان در زمینه علوم زیستی هستیم. محصولات مرتبط ارائه شده توسط Yeasen به شرح زیر است:

جدول 2. لیست محصولات مرتبط