با توسعه سریع بیوتکنولوژی، mRNA درمانی به عنوان یک روش درمانی نوظهور، به دلیل قابلیت برنامه ریزی قوی و سرعت پاسخ سریع، توجه بسیاری را به خود جلب کرده است. در زمینه واکسن‌های mRNA و ژن‌درمانی، سنتز مؤثر mRNA با کیفیت بالا گامی کلیدی در دستیابی به اهداف درمانی است. در طی این فرآیند، T7 RNA پلیمراز (T7 RNAP) نقش اساسی ایفا می کند، می تواند به طور موثر سنتز mRNA را در شرایط آزمایشگاهی کاتالیز کند.
اگرچه T7 RNAP نقش مهمی در سنتز mRNA ایفا می کند، اما اغلب RNA دو رشته ای (dsRNA) را به عنوان یک محصول جانبی در عمل تولید می کند. dsRNA یکی از مشخصه‌های بسیاری از ویروس‌ها است و به همین دلیل به راحتی توسط پروتئین‌های متصل شونده به dsRNA درون سلولی شناسایی می‌شود و پاسخ‌های ایمنی ذاتی و واکنش‌های التهابی را تحریک می‌کند. این بدان معناست که اگر فرمول‌های mRNA حاوی سطح بالاتری از dsRNA باشد، ممکن است منجر به فعال‌سازی غیرضروری ایمنی شود که می‌تواند بر اثربخشی درمانی تأثیر بگذارد یا عوارض جانبی جدی ایجاد کند. dsRNA بیش از حد همچنین می تواند با عملکرد طبیعی mRNA، از جمله کارایی ترجمه و پایداری mRNA، تداخل داشته باشد و به طور غیر مستقیم بر اثربخشی mRNA درمانی تأثیر بگذارد.
شکل 1: تاثیر محصولات جانبی dsRNA و واکنش بهینه T7 RNAP.
بنابراین، توسعه و اتخاذ روش‌های مؤثر برای کاهش تولید dsRNA بخش مهمی از توسعه فناوری mRNA است. محققان استراتژی های مختلفی از جمله استفاده از RNA پلیمرازهای بهبود یافته T7، نوکلئوتیدهای اصلاحی، بهینه سازی بافرهای رونویسی IVT و فرآیندهای تصفیه پایین دستی را توسعه داده اند. Yeasen Biology از قابلیت‌های پلتفرم تکامل هدایت‌شده ZymeEditor خود برای تکامل مداوم مواد خام آنزیم اصلی برای سنتز mRNA در شرایط آزمایشگاهی - RNA پلیمراز T7 استفاده می‌کند. ما یک dsRNA T7 RNA پلیمراز کم ایجاد کرده‌ایم که فعالیت RDRP RNA پلیمراز T7 را سرکوب می‌کند و اساساً تشکیل dsRNA را کاهش می‌دهد و در نتیجه محتوای dsRNA را به میزان قابل توجهی کاهش می‌دهد.
اطلاعات محصول
بازده: بیش از 9 میلی گرم در میلی لیتر
محتوای dsRNA: محتوای dsRNA به میزان قابل توجهی حداقل 10 برابر کاهش یافته است
راندمان پوشش: بیش از 99٪
dsRNA T7 RNA پلیمراز کم فرآیند غربالگری:
1) ساخت یک کتابخانه تصادفی و روش غربالگری با توان بالای FADS، یک کتابخانه جهش تصادفی بیش از 10^6 غربالگری شد.
2) طراحی نیمه منطقی و فناوری میکروپلیت برای غربالگری یک کتابخانه اشباع شده از سایت استفاده شد. هر دو روش جهش RNA پلیمراز T7 dsRNA کم به همراه داشت. با در نظر گرفتن محتوای dsRNA در حالی که اطمینان حاصل می شود که سایر شاخص ها کاهش نمی یابند (مانند یکپارچگی/بازده سقفی/بازده و غیره)، چندین جهش انتخاب شدند و یکی به نام CleaScrip™ T7 برای کاربرد تجاری استفاده شد.
اطلاعات محصول
در سناریوهای کاربردی با طول های مختلف، dsRNA T7 RNA پلیمراز پایین کاهش بسیار قابل توجهی را در مقایسه با WT T7 و محصولات رقابتی نشان داده است، در حالی که تضمین می کند که بازده و یکپارچگی کاهش نمی یابد.
| طول قطعه | T7 RNA pol | بازده (mg/ml) |
صداقت (%) | محتوای dsRNA (ng dsRNA تولید شده در هر 1 میکروگرم RNA) |
| 4K | T7-WT | 12.4 | 88.3 | 0.4273 |
| CleaScrip™ T7 | 12.1 | 89.9 | 0.0129 | |
| شرکت A | 11.0 | 87.8 | 0.0323 | |
| 9K | T7-WT | 9.5 | 81.9 | 2.9180 |
| CleaScrip™ T7 | 9.0 | 82.0 | 0.0379 | |
| شرکت A | 7.2 | 78.7 | 0.1805 |
با استفاده از غلظت کلاهک 2.5 میلی‌مولار، راندمان دربندی عالی همچنان در طول قطعات مختلف در مقایسه با WT قابل دستیابی است. علاوه بر این، عملکرد بیان پروتئین برتر نیز در سطح سلولی مشاهده می شود.
| ورودی آنالوگ درپوش (میلی متر) | بهره وری درپوش (Capping Efficiency)%)4K | |
| WT | dsRNA کم | |
| 10 | 100 | 100 |
| 5 | 100 | 100 |
| 2.5 | 100 | 100 |
ثبت اختراع در ایالات متحده ارائه شده است.
اطلاعات محصول
| نام محصول | شماره کاتالوگ | مشخصات | حجم |
| پاک کردنTM T7 RNA پلیمراز (dsRNA کم، 250 U/μL) | 10628ES | 100 / 2500 / 25,000 KU | 400 میکرولیتر/10 میلی لیتر/100 میلی لیتر |
| 10629ES | 100 / 2500 / 25,000 KU | 400 میکرولیتر/10 میلی لیتر/100 میلی لیتر |