را دشرح کیت سنتز RNA با بازده بالا T7

کیت سنتز RNA با بازده بالا T7 سیستم واکنش رونویسی را بهینه می کند. این کیت می تواند RNA تک رشته ای را با استفاده از T7 RNA پلیمراز به طور موثر سنتز کند. لDNA دو رشته ای با توالی پروموتر T7 به عنوان الگو، NTPs به عنوان بستر برای رونویسی توالی DNA پایین دست پروموتر. در طول رونویسی، نوکلئوتیدهای اصلاح شده می توانند همچنین به عنوان سوبسترا برای تولید بیوتین یا RNA نشاندار شده با رنگ اضافه شود.

این کیت می تواند سنتز شود هر دو رونوشت های بلند و رونوشت های کوتاه، RNA را می توان 100-200 میکروگرم با 1 میکروگرم ورودی الگوی DNA تولید کرد. RNA سنتز شده توسط رونویسی می تواند برای کاربردهای مختلف پایین دستی مانند تحقیق ساختار و عملکرد RNA استفاده شود.ساعتes، حفاظت از RNase، هیبریداسیون پروب، RNAi، تزریق میکرو، و ترجمه آزمایشگاهی.

اصل سنتز

شکل 1: فرآیند رونویسی RNA در شرایط آزمایشگاهی

مزایای محصول

بازده بالا: می تواند تا 200 میکروگرم را در 2 ساعت از طریق واکنش رونویسی تولید کند

تطبیق پذیری بهتر: مناسب برای رونویسی RNA 20nt-10000nt

عملکرد عالی: به طور موثر محصولات جانبی رونویسی را در طول فرآیند IVT کاهش می دهد

چند برنامه کاربردی: می تواند برای سنتز RNA معمولی، نشاندار شده و اصلاح شده استفاده شود

خواص محصول

شکل 2: بازده رونوشت های با طول های مختلف

شکل 3: کیفیت رونوشت ها با طول های مختلف

شکل 4: بیان از رونویسی کرد mRNA در HEK-293 سلول ها

توجه: mRNA با آنزیم پوشاننده واکسینیا (Yeasen#10614/10615) پوشیده شده است.

روش های تجربی

معرف های ذوب

T7 RNA Polymerase را برای مدت کوتاهی سانتریفیوژ کرده و بگذارید آن را روی یخ ذوب 10× بافر رونویسی و ریبونوکلئوتیدس (ATP، CTP، GTP، UTP)، مخلوط کرده و در انتهای لوله سانتریفیوژ کنید، 10×Transcription Buffer را در دمای اتاق قرار دهید و 4 نوع ریبونوکلئوتید را روی یخ قرار دهید.

ب.واکنش رونویسی مونتاژ در دمای اتاق

سیستم واکنش را طبق سیستم زیر آماده کنید:

اجزاء	حجم (µL)	غلظت نهایی
H بدون RNase₂O	تا 20	-
10× بافر رونویسی	2	1×
CTP / GTP / ATP / UTP (هر کدام 100 میلی‌مولار)	هر کدام 2 عدد	هر کدام 10 میلی متر
DNA الگو	1 میکروگرم	-
مخلوط RNA پلیمراز T7	2	-

یادداشت ها:

واکنش در دمای اتاق پیکربندی می شود. از آنجایی که بافر رونویسی 10 × حاوی اسپرمیدین است، غلظت بالای اسپرمیدین ممکن است باعث رسوب الگوی DNA در دمای پایین شود.
برای رونوشت های کوتاه (<100 nt)، می توان از الگوی 2 میکروگرم استفاده کرد، زمان رونویسی به 4-8 ساعت افزایش می یابد.
3. برای رونوشت های طولانی (> 1000 nt)، توصیه می شود از پلاسمیدهای خطی به عنوان الگوهایی برای رونویسی استفاده کنید.
4. واکنش را در دستگاه PCR با درب داغ باز انجام دهید تا از تبخیر جلوگیری شود.
5. محصول واکنش ممکن است دارای رسوب سفید باشد. رسوب منیزیم پیروفسفات تولید شده توسط یون های پیروفسفات و منیزیم آزاد در محلول واکنش که آزمایش های بعدی را تحت تاثیر قرار نمی دهد. اگر می خواهید آن را حذف کنید، می توانید مقداری EDTA اضافه کنید. اگر افزودن EDTA بر آزمایش‌های بعدی تأثیر بگذارد، مایع رویی نیز می‌تواند با سانتریفیوژ بازیابی شود.
6. معرف ها و ظروف را بدون آلودگی RNase نگهداری کنید.

C. در دمای 37 درجه سانتی گراد به مدت 2 ساعت انکوبه کنید

محلول اجزا را با هم مخلوط کرده، برای مدت کوتاهی در انتهای لوله سانتریفیوژ کرده و در دمای 37 درجه سانتیگراد به مدت 2 ساعت انکوبه کنید. اگر طول رونوشت کمتر از 100 nt باشد، زمان واکنش را به 4-8 ساعت افزایش دهید.

درمان D.DNase I (اختیاری)

پس از تکمیل واکنش، 2 میکرولیتر DNase I (بدون RNase) به هر لوله اضافه کنید و در دمای 37 درجه سانتیگراد به مدت 15 دقیقه انکوبه کنید تا DNA الگو حذف شود.

سوالات متداول

بازده رونوشت پایین

کیفیت قالب ارتباط نزدیکی با بازده دارد. عملکرد گروه آزمایش به طور معنی داری کمتر از گروه کنترل است. دلایل احتمالی عبارتند از:

الگوی تجربی شامل اجزای بازدارنده است.
شاید الگو مشکلی داشته باشد.

پیشنهادات: ① الگو را دوباره پاکسازی کنید. ② تعیین کمیت الگو و یکپارچگی آن؛ ③ زمان واکنش را افزایش دهید. ④ مقدار ورودی الگو را افزایش دهید. ⑤ از سایر مروجین و سایر RNA پلیمرازها

بازده کم رونوشت های کوتاه

قطعات قالب کوتاه می توانند واکنش را مهار کنند. هنگامی که محصول رونویسی کمتر از 100 nt است، اگر می خواهید بازده را افزایش دهید، زمان واکنش را به 4-8 ساعت افزایش دهید یا مقدار الگو را تا 2 میکروگرم افزایش دهید.

طول رونویسی RNA است بزرگتر بیش از حد انتظار

اگر نتیجه الکتروفورز نشان دهد که باند محصول بزرگتر از اندازه مورد انتظار است، دلایل احتمالی ممکن است این باشد: ①قالب پلاسمید ممکن است کاملاً خطی نباشد. ② انتهای 3' رشته حس دارای ساختار برجسته است. ③ RNA ساختار ثانویه ای دارد که به طور کامل دناتوره نشده است.

پیشنهادات: ① بررسی کنید که آیا الگو کاملاً خطی شده است یا خیر، و در صورت لزوم، خطی سازی اضافی را انجام دهید. ②یک آنزیم محدود کننده مناسب را برای جلوگیری از اورهانگ های 3' انتخاب کنید، یا برای تکمیل رونویسی قبل از ادامه از Klenow Fragment /T4 DNA polymerase استفاده کنید. ③ از ژل دناتوره شده برای تشخیص محصولات RNA استفاده کنید.

طول رونویسی RNA است کوچکتر بیش از حد انتظار

اگر الکتروفورز نشان دهد که نوار محصول کوچکتر از اندازه مورد انتظار است، دلایل احتمالی وجود دارد عبارتند از: ① الگو شامل یک توالی خاتمه شبیه به پایان دهنده RNA پلیمراز T7 است. ②محتوای GC از قالب خیلی بالاست

پیشنهادات: ①دمای واکنش را کاهش دهید (مثلاً 30 درجه سانتیگراد). گاهی اوقات کاهش دما می تواند به افزایش طول رونویسی کمک کند، اما ممکن است بازده را کاهش دهد. دیگر را امتحان کنید RNA پلیمرازها برای رونویسی؛ ②اگر محتوای GC الگو زیاد است، واکنش را در دمای 42 ℃ انجام دهید، یا SSB را برای افزایش بازده و طول رونویسی اضافه کنید.

باطله الکتروفورتیک محصولات رونویسی

دم در طول الکتروفورز ممکن است ناشی از موارد زیر باشد: ① آلودگی RNase در طول عملیات آزمایشی. ②الگوی DNA به RNase ها آلوده شده است.

پیشنهادات: ① از نوک پیپت های بدون RNase و لوله های EP استفاده کنید، از دستکش و ماسک لاتکس یکبار مصرف استفاده کنید و همه معرف ها با H بدون RNase تهیه شوند.₂O. ②DNA الگو را دوباره خالص کنید.

اطلاعات سفارش

نام محصول	شماره کاتالوگ	استشدید
کیت سنتز RNA با بازده بالا T7	10623ES	50/100/500 T
T7 RNA Polymerase GMP-grade (250 U/μL)	10625ES	10KU/100KU/2500KU/25MU
پیروفسفاتاز، درجه GMP معدنی (1 U/μL)	10620ES	10U/100U/1000U
مهارکننده RNase موشی درجه GMP (40 U/μL)	10621ES	10KU/20KU/100KU/1MU
mRNA واکسینیا پوشش آنزیم GMP درجه	10614ES	2KU/10KU/100KU
mRNA Cap 2'-O-Methyltransferase GMP-grade	10612ES	10KU/50KU/250KU
دئوکسی ریبونوکلئاز I (DNase I) درجه GMP	10611ES	500/2000/10000 U
کیت اصلی جداسازی mRNA Hieff NGS	12603ES	24/96 ت

مقاله بعدی