شرح
کیت سنتز RNA با بازده بالا T7 سیستم واکنش رونویسی را بهینه می کند. این کیت می تواند RNA تک رشته ای را با استفاده از T7 RNA پلیمراز، DNA خطی دو رشته ای با توالی پروموتر T7 به عنوان الگو، NTPs به عنوان بستری برای کنترل توالی DNA در پایین دست پروموتر سنتز کند. در طول رونویسی، نوکلئوتیدهای اصلاح شده را می توان به سوبسترا اضافه کرد تا بیوتین یا RNA نشاندار شده با رنگ آماده شود.
این کیت می تواند رونوشت های بلند و رونوشت های کوتاه را سنتز کند، RNA را می توان 100-200 میکروگرم با 1 میکروگرم ورودی الگوی DNA تولید کرد. RNA سنتز شده توسط رونویسی می تواند برای کاربردهای مختلف پایین دست، مانند تحقیقات ساختار و عملکرد RNA، حفاظت از RNase، هیبریداسیون پروب، RNAi، تزریق میکرو و در شرایط آزمایشگاهی استفاده شود. ترجمه
شکل 1: در شرایط آزمایشگاهی فرآیند رونویسی RNA
ویژگی
- حداکثر 180 میکروگرم RNA در هر واکنش از 1 میکروگرم از الگوی کنترل
- سیستم واکنش بهینه برای فرآیند IVT
- کاهش تولید dsRNA
- یکپارچگی و خلوص RNA بالاتر
برنامه
- در شرایط آزمایشگاهی سنتز RNA
اجزاء
| اجزای شماره | نام | 10623ES50 (50 T) | 10623ES60 (100 T) | 10623ES70 (500 T) |
| 10623-A | مخلوط RNA پلیمراز T7 | 100 میکرولیتر | 200 میکرولیتر | 1 میلی لیتر |
| 10623-B | 10× بافر رونویسی | 100 میکرولیتر | 200 میکرولیتر | 1 میلی لیتر |
| 10623-C | ATP (100 میلی‌مولار) | 100 میکرولیتر | 200 میکرولیتر | 1 میلی لیتر |
| 10623-D | CTP (100 میلی‌متر) | 100 میکرولیتر | 200 میکرولیتر | 1 میلی لیتر |
| 10623-E | GTP (100 میلی متر) | 100 میکرولیتر | 200 میکرولیتر | 1 میلی لیتر |
| 10623-F | UTP (100 میلی متر) | 100 میکرولیتر | 200 میکرولیتر | 1 میلی لیتر |
| 10623-G | الگوی DNA کنترل (500ng/μL) | 10 میکرولیتر | 20 میکرولیتر | 100 میکرولیتر |
حمل و نقل و ذخیره سازی
حمل و نقل یخ خشک در دمای 15- ~ 25- درجه سانتیگراد نگهداری شود که دو سال اعتبار دارد.
ارقام
شکل 1. RNA استاندارد در شرایط آزمایشگاهی با استفاده از کیت سنتز RNA T7 سنتز شد.
واکنش در دستگاه PCR در دمای 37 درجه سانتیگراد به مدت 2 ساعت انکوبه شد و سپس با مهره های مغناطیسی خالص شد (Cat#12602). نتیجه بازده توسط اسپکتروفتومتر NanoDrop همانطور که در شکل 1 نشان داده شده است مورد تجزیه و تحلیل قرار گرفت.
شکل 2. نمایش رونویسی طول های مختلف RNA توسط کیت T7 به ترتیب در الکتروفورتوگرام (شکل 2A)، نمودار الکتروفورز مویرگی (شکل 2B)، و کروماتوگرام (شکل 2C)
شکل 3. سنتز RNA سرپوشیده در شرایط آزمایشگاهی.
واکنش در دستگاه PCR در دمای 37 درجه سانتیگراد به مدت 2 ساعت انکوبه شد و سپس با مهره های مغناطیسی خالص شد (Cat#12602). نتیجه بازده توسط اسپکتروفتومتر NanoDrop همانطور که در شکل 3A نشان داده شده است مورد سنجش قرار گرفت. نتیجه یکپارچگی با الکتروفورز مویرگی همانطور که در شکل 3B نشان داده شده است، تجزیه و تحلیل شد.
1. بازده رونوشت پایین
کیفیت قالب ارتباط نزدیکی با بازده دارد. اگر عملکرد گروه آزمایش به طور قابل توجهی کمتر از گروه کنترل باشد، دلایل احتمالی عبارتند از:
① الگوی تجربی شامل اجزای بازدارنده است.
② الگو مشکلی دارد.
پیشنهادات:
① قالب را مجدداً تمیز کنید.
② تعیین کمیت الگو و یکپارچگی آن؛
③ زمان واکنش را افزایش دهید.
④ مقدار ورودی الگو را افزایش دهید.
⑤ سایر پروموترها و RNA پلیمرازها را امتحان کنید.
2. بازده کم رونوشت های کوتاه
یک قطعه کوتاه شروع رونویسی واکنش را مهار می کند. هنگامی که محصول رونویسی کمتر از 100 nt باشد، افزایش زمان واکنش به 4-8 ساعت یا افزایش مقدار الگو تا 2 میکروگرم باعث افزایش بازده RNA می شود.
3. طول رونویسی RNA بیشتر از حد انتظار است
اگر الکتروفورز نشان دهد که نوار محصول بزرگتر از اندازه مورد انتظار است، دلایل احتمالی:
① الگوی پلاسمید ممکن است کاملاً خطی نباشد.
② انتهای 3' رشته حس دارای ساختار برجسته است.
③ RNA ساختار ثانویه ای دارد که به طور کامل دناتوره نشده است.
پیشنهادات:
① بررسی کنید که آیا الگو کاملاً خطی شده است یا خیر، و در صورت لزوم، خطی سازی اضافی را انجام دهید.
②یک آنزیم محدود کننده مناسب را برای جلوگیری از اورهانگ های 3' انتخاب کنید، یا برای تکمیل رونویسی قبل از ادامه از Klenow Fragment /T4 DNA polymerase استفاده کنید.
③ از ژل دناتوره شده برای تشخیص محصولات RNA استفاده کنید.
4. طول رونویسی RNA کمتر از حد انتظار است
اگر الکتروفورز نشان داد که نوار محصول کوچکتر از اندازه مورد انتظار است، دلایل احتمالی:
① الگو شامل یک توالی خاتمه شبیه به T7 RNA پلیمراز است.
②محتوای GC در قالب بالا است.
پیشنهادات:
①دمای واکنش را کاهش دهید (مثلاً 30 درجه سانتیگراد). گاهی اوقات کاهش دما می تواند طول رونویسی را افزایش دهد، اما بازده را کاهش می دهد. یا RNA پلیمرازهای مختلف را برای رونویسی امتحان کنید.
②اگر محتوای GC الگو زیاد است، از 42℃ استفاده کنید رونویسی کنید، یا SSB را برای افزایش بازده و طول رونویسی اضافه کنید.
5. باطله الکتروفورز محصولات رونویسی
در طول الکتروفورز یک پدیده باطله وجود دارد.
دلایل احتمالی:
① در طول عملیات آزمایشی توسط RNase آلوده شده است.
②الگوی DNA آلوده به RNase.
پیشنهادات:
① از نوک پیپت های بدون RNase و لوله های EP استفاده کنید، از دستکش و ماسک لاتکس یکبار مصرف استفاده کنید و همه معرف ها با H2O بدون RNase تهیه می شوند.
② DNA الگو را دوباره خالص کنید.
[1] دونگ زی، ژنگ ان، هو سی، و همکاران.Nosema bombycis microRNA RNA 8 (Nb-milR8) با تعدیل بیان ژن BmPEX16 در میزبان خود، Bombyx mori، بیماری زایی قارچ را افزایش می دهد. طیف میکروبیول 2021; 9 (2): e0104821. doi:10.1128/Spectrum.01048-21(IF:7.171)
[2] وانگ ایکس، تانگ اس، یه اس، و همکاران. کمی سازی فوق حساس miR-195-5p در گردش با آبشار تقویت جابجایی سه رشته ای. تالانتا. 2022; 242:123300. doi:10.1016/j.talanta.2022.123300(IF:6.057)
پرداخت و امنیت
اطلاعات پرداخت شما با اطمینان پردازش می شود. ما جزئیات کارت اعتباری را ذخیره نمی کنیم و به اطلاعات کارت اعتباری شما دسترسی نداریم.
تحقیق
شما همچنین ممکن است دوست داشته باشید
پرسش
این محصول فقط برای اهداف تحقیقاتی است و برای استفاده درمانی یا تشخیصی در انسان یا حیوانات در نظر گرفته نشده است. محصولات و محتوا توسط پتنت ها، علائم تجاری، و حق چاپ متعلق به Yeasen Biotechnology محافظت می شوند. نمادهای علامت تجاری نشان دهنده کشور مبدا هستند، نه لزوما ثبت در همه مناطق.
برخی از برنامه‌های کاربردی ممکن است به حقوق مالکیت معنوی شخص ثالث دیگری نیاز داشته باشند.
Yeasen به علم اخلاق اختصاص داده شده است و معتقد است که تحقیقات ما باید به سؤالات مهم و در عین حال اطمینان از ایمنی و استانداردهای اخلاقی بپردازد.