دستاورد بزرگ از Yeasen و بیوتکنولوژی Molefuture

با توسعه سریع بیوتکنولوژی، mRNA درمانی به عنوان یک روش درمانی نوظهور، به دلیل قابلیت برنامه ریزی قوی و سرعت پاسخ سریع، توجه بسیاری را به خود جلب کرده است. در زمینه هایی مانند واکسن های mRNA و ژن درمانی، سنتز کارآمد mRNA با کیفیت بالا گامی حیاتی در دستیابی به اهداف درمانی است. در این فرآیند، T7 RNA پلیمراز نقش مهمی ایفا می کند، زیرا می تواند به طور موثر سنتز mRNA را در شرایط آزمایشگاهی کاتالیز کند.

موضوع محصول جانبی dsRNA مربوط به RNA پلیمراز T7

اگرچه RNA پلیمراز T7 نقش مهمی در سنتز mRNA ایفا می کند، عملیات واقعی اغلب منجر به تولید RNA دو رشته ای (dsRNA) به عنوان یک محصول جانبی می شود. حضور dsRNA نه تنها بازده و خلوص mRNA را کاهش می‌دهد، بلکه ممکن است پاسخ‌های ایمنی غیراختصاصی را تحریک کند و بر کارایی و ایمنی تأثیر بگذارد. بنابراین، کاهش تولید dsRNA به یک نیاز فوری در صنعت تبدیل شده است. در حال حاضر، روش‌های کاهش dsRNA عمدتاً شامل بهینه‌سازی شرایط واکنش و استفاده از آنزیم‌های کمکی است. اگرچه این روش ها می توانند تولید dsRNA را تا حدودی کاهش دهند، اما اغلب با مسائلی مانند عملیات پیچیده و افزایش هزینه ها همراه هستند.

چرا باید مهندسی T7 RNA پلیمراز را انجام دهیم؟

اصلاح مستقیم RNA پلیمراز T7 برای کاهش تولید dsRNA راه حل اساسی تری است. تکنیک های تکامل آنزیمی می تواند خواص کاتالیزوری آن را بهبود بخشد و خلوص و بازده محصولات را با تغییر دقیق توالی اسید آمینه یا ساختار آنزیم افزایش دهد. برای T7 RNA پلیمراز، اصلاح هدفمند نه تنها می تواند تولید dsRNA را کاهش دهد، بلکه کارایی و کیفیت کلی سنتز mRNA را نیز افزایش می دهد.

Yeasen به عنوان تامین کننده mRNA مواد خام سنتز آزمایشگاهی بیوتکنولوژی و شرکت تابعه آن Molefuture بیوتکنولوژی، دارند یک RNA پلیمراز جدید T7 را با استفاده از پلتفرم تکامل هدایت شده ZymeEditor ایجاد کرد. به منظور به حداقل رساندن تولید محصولات جانبی مانند dsRNA در طی فرآیندهای رونویسی آزمایشگاهی، تیم تکامل RNA پلیمراز T7 را از طریق ترکیبی از طراحی منطقی و غربالگری هدایت شده مهندسی کرده است.

چگونه dsRNA تولید می شود؟

بر اساس گزارشات ادبیات، تولید محصول جانبی dsRNA عمدتاً از دو منبع منشأ می‌گیرد (شکل 1): اولین مورد در طول انتقال RNA پلیمراز T7 از ترکیب اولیه به ترکیب طولی در مراحل اولیه رونویسی است، کمپلکس سه‌گانه رونویسی مستعد تجزیه است [1]، که منجر به انتشار RNA کوتاه با طول RNA در اطراف یک زنجیره بزرگ می‌شود. 20 nt به سیستم. این زنجیره‌های RNA به‌عنوان «پرایمر» عمل می‌کنند، که با زنجیره‌های طولانی RNA جفت می‌شوند و برای تولید dsRNA تحت تأثیر فعالیت RNA پلیمراز وابسته به RNA T7 (فعالیت RDRP) گسترش می‌یابند [2،3]. منبع دوم توسط فعالیت انتقال ریبونوکلئوتید پایانی که توسط T7 RNA پلیمراز در اختیار دارد، ایجاد می شود. هنگامی که واکنش رونویسی به انتهای الگوی خطی می رسد، RNA پلیمراز T7 ممکن است به طور تصادفی چندین ریبونوکلئوتید را بدون وابستگی به الگو اضافه کند. این ریبونوکلئوتیدها، که "پرایمرهای تصادفی" را تشکیل می دهند، ممکن است معکوس شوند و به طور مکمل با ناحیه mRNA هدف جفت شوند و برای تولید dsRNA گسترش یابند. dsRNA تولید شده از طریق حلقه، dsRNA حلقه بک [3،4] نامیده می شود. بنابراین، به منظور کاهش محصولات جانبی dsRNA، تمرکز اصلاح RNA پلیمراز T7 در تثبیت کمپلکس سه تایی رونویسی اولیه یا تضعیف فعالیت انتقال پایانی و RNA پلیمراز وابسته به RNA (RDRP) است. فعالیت RNA پلیمراز T7

شکل 1. نمودار شماتیک سد انرژی و اصل تشکیل dsRNA (داده های منتشر نشده)

چگونه غلبه کنیم سد انرژی T7 RNA پلیمراز انتقال ساختاری?

از طریق تجزیه و تحلیل ساختاری و انرژی آزاد، تیم از یک سو متوجه شد که همراه با تغییرات ساختاری T7 RNA پلیمراز، تغییری در انرژی نیز وجود دارد. انرژی آزاد ترکیب ازدیاد طول به طور قابل توجهی بالاتر از ترکیب اولیه است، که نشان می دهد که فرآیند رونویسی برای تولید زنجیره های mRNA کامل نیاز به غلبه بر یک سد انرژی بالاتر دارد. یک سد انرژی بالا برای انتقال ساختاری صاف نامطلوب است. بنابراین، تیم استفاده کرد منطقی روش های غربالگری برای شناسایی بیش از 20 اسید آمینه کانونی و ساخت کتابخانه های جهش زایی اشباع مربوطه.

نحوه اصلاح فعالیت های انتقال پایانی و RDRP T7 RNA پلیمراز

از سوی دیگر، با توجه به گزارش‌های محدود در مورد عملکردها، مکان‌ها و حوزه‌های ساختاری مربوط به انتقال پایانی و فعالیت‌های RDRP T7 RNA پلیمراز، و به دلیل اینکه این دو فعالیت، که از نظر عملکردی مشابه هستند، احتمالاً مکان‌های کلیدی را با واکنش اصلی T7 RNA پلیمراز مشترک دارند - فعالیت رونویسی (یعنی، فعالیت پلیمریزاسیون اسید آمینه وابسته به DNA، یافتن مکان‌های تغییر اسید آمینه وابسته به دی‌ان‌ای، یافتن مکان‌های اصلاحی اسید آمینه مستقیم برای DDRP) بنابراین، این تیم به طور همزمان چندین کتابخانه جهش تصادفی را بر اساس PCR مستعد خطا، همراه با ظرفیت تکامل بالای پلتفرم ZymeEditor، ایجاد کردند که منجر به تنوع بیش از 10^6 برای هر کتابخانه جداگانه شد.

کشف ایده آل مبتنی بر کاوشگر T7 RNA پلیمراز

برای ایجاد تعادل در تولید RNA پلیمراز T7 و نظارت بر محتوای dsRNA در واکنش رونویسی آزمایشگاهی، این تیم با اشاره به الگوهای رونویسی بهینه شده، چندین فلورسنت را با دقت طراحی کردند. کاوشگرهایی که مناطق مختلف محصولات mRNA هدف را هدف قرار می دهند. این کاوشگرها اطلاعاتی مانند بازده واکنش، یکپارچگی و محتوای dsRNA در سیستم را با سیگنال های فلورسانس مرتبط می کنند. هر چه شدت فلورسانس سیستم قوی تر باشد، عملکرد جهش یافته سودمندتر است. در تئوری، این روش غربالگری می‌تواند جهش‌یافته‌ها را بر اساس شدت فلورسانس پروب‌های مختلف رتبه‌بندی کند، جهش‌یافته‌های RNA پلیمراز T7 با بازده بالا یا RNA سقط‌کننده کاهش‌یافته و همچنین جهش‌یافته‌ها با یکپارچگی بهبود یافته یا کاهش dsRNA حلقه‌ای را به دست آورد. هنگامی که الگوی واکنش با RNA جایگزین می‌شود، جهش‌هایی با فعالیت RDRP کاهش یافته نیز می‌توانند به طور منفی غربال شوند و انتخاب الگوی T7 RNA پلیمراز را بهبود بخشد. علاوه بر این، با افزودن نوکلئوتیدهای اصلاح‌شده، آنالوگ‌های کلاهک و افزایش دمای واکنش در سیستم واکنش قطره‌ای، می‌توان غربالگری بیشتری را برای انتخاب جهش‌های RNA پلیمراز T7 انجام داد که بسترهای غیرطبیعی را تحمل می‌کنند و پایداری حرارتی بهبود یافته را نشان می‌دهند.

چگونه بهترین صفحه نمایش را انجام دهیم T7 RNA پلیمراز?

بر اساس اندازه کتابخانه ها، تیم فرآیندهای غربالگری با توان بالا بر اساس مرتب‌سازی قطرات فعال شده با فلورسانس (FADS) و فرآیندهای غربالگری با توان بالا بر اساس روش‌های سنتی میکروپلیت (MTPS) ایجاد کردند.از طریق دورهای متعدد آزمایش، بیش از 10^7 جهش در مجموع غربال شد، که منجر به جهش های متعدد با کاهش قابل توجه محتوای dsRNA شد. در میان آنها، برخی از جهش‌یافته‌ها کاهش dsRNA ناشی از RNA سقط‌کننده را در واکنش نشان دادند، که نشان می‌دهد ترکیب طولی این موتانت‌های پلیمراز پایدارتر است. برخی جهش‌یافته‌ها کاهش محتوای dsRNA حلقه‌ای را در واکنش نشان دادند که نشان‌دهنده تضعیف فعالیت انتقال پایانی یا فعالیت RDRP در این جهش‌یافته‌ها است.

با توجه به اینکه مزایای عملکردی جهش یافته های فوق از مکانیسم های مختلف ناشی می شود، تیم کتابخانه های ترکیبی DNA را برای هدف قرار دادن آنها ساخته است. پس از غربالگری، تیم در نهایت جهش یافته با عملکرد برتر را به دست آورد با تولید dsRNA بسیار کم در حالی که بر بازده و یکپارچگی mRNA تأثیر نمی گذارد (شکل 2). با این حال، بازده یک جهش یافته G47A+884G کشف شده توسط مدرنا تحت تأثیر قرار گرفت.^[5] (چاپ نشده).

شکل 2. فرآیند تکامل آنزیم و توصیف عملکرد جهش یافته

(چاپ نشده)

تجزیه و تحلیل تولید dsRNA توسط T7 RNA پلیمراز انواع؟

پس از تجزیه و تحلیل کمی، همانطور که در شکل 3 نشان داده شده است، با استفاده از یک الگوی رونویسی 9 کیلوبایتی تحت شرایط پوشش همزمان رونویسی، پلیمراز T7 RNA نوع وحشی تقریباً 2.9 نانوگرم بر میکروگرم dsRNA را هنگام استفاده از نوکلئوتیدهای طبیعی تولید کرد، در حالی که یک محصول تجاری بود. آنزیم T7 حدود 0.18 نانوگرم بر میکروگرم dsRNA تولید کرد. با این حال، تولید dsRNA هر گونه پلیمراز RNA T7 ساخته شده کمتر از 0.10 نانوگرم بر میکروگرم بود. به خصوص، یکی نوع تنها 0.015 نانوگرم در میکروگرم بود که تقریباً 200 برابر کمتر از نوع وحشی و 12 برابر کمتر از نوع تجاری بود. محصول پس از آزمایش های مکرر، مزیت عملکرد انواع در کاهش dsRNA به طور مداوم تحت شرایط واکنش های مختلف مشاهده شد، که نشان دهنده سازگاری سیستم خوب این جهش ها و ایجاد پایه ای برای کاهش بیشتر تولید dsRNA از طریق بافر واکنش است. بهینه سازی علاوه بر این، غربالگری FADS همچنین انواع مختلفی را با یکپارچگی محصول و پایداری حرارتی بهبود یافته به دست آورد که می تواند نیازهای طیف وسیع تری از کاربردهای رونویسی in vitro را برآورده کند.

شکل 3. ارزیابی تولید dsRNA توسط انواع T7 RNA پلیمراز که با استفاده از کیت الایزا RNA دو رشته ای Yeasen (dsRNA) و آنالیز نقطه بلات آنتی بادی J2 ارزیابی شد.

در حال حاضر، چندین شریک قبلاً انواع T7 RNA پلیمراز را امتحان کرده اند و ما تحسین زیادی از آنها دریافت کرده ایم. استفاده از آنزیم جدید فرآیند خالص سازی mRNA را ساده می کند، کارایی کار را افزایش می دهد و عملکرد فوق العاده ای را در سناریوهای کاربردی متعدد نشان می دهد.

این گونه ها در برنامه های ثبت اختراع هستند و ما از بحث برای همکاری فناوری و صدور مجوز استقبال می کنیم.

درباره بیوتکنولوژی Molefuture

Molefuture Biotechnology یکی از شرکت های تابعه Yeasen است Biotechnology (Shanghai) Co., Ltd.، متخصص در ارائه راه حل های سفارشی اصلاح آنزیم که توسط فناوری تکامل آنزیم هدایت می شود.استفاده از منابع Yeasen بیوتکنولوژی، Molefuture بر روی شش پلتفرم تکنولوژیکی اصلی فعالیت می‌کند: پلت‌فرم تکامل آنزیم نوآورانه ZymeEditor، یک پلت‌فرم بیان با کارایی بالا چند میزبان، پلت‌فرم توسعه فرآیند تخمیر، پلت‌فرم توسعه فرآیند تصفیه، پلت‌فرم تولید آنزیم فوق‌العاده تمیز، و پلت‌فرم تجزیه و تحلیل آنزیم و کنترل کیفیت. با این شش پلتفرم فناوری، Molefuture می‌تواند مجموعه کاملی از راه‌حل‌های سفارشی‌شده از جمله تکامل مبتنی بر آنزیم، توسعه آنزیم‌های جدید، توسعه فرآیند آنزیمی، و تولید مقیاس‌پذیر در سطح GMP را برای برآورده کردن نیازهای کاربردی آنزیم‌ها در زمینه‌هایی مانند تشخیص آزمایشگاهی، زیست‌پزشکی، زیست‌شناسی مصنوعی، داروسازی بین‌المللی، زیبایی‌شناسی پزشکی ارائه دهد. al.

اطلاعات سفارش

محصولات زیر نمایندگی ارائه شده توسط Yeasen می باشد. اندازه های اضافی موجود است. محصولات ما بسیار بهینه شده اند تا به طور هماهنگ کار کنند تا از عملکرد و تکرارپذیری برتر اطمینان حاصل شود. ما همچنین می توانیم خدمات سفارشی ارائه دهیم. اگر به محصولی که نمایش داده نمی شود علاقه مند هستید، با ما تماس بگیرید و ما برای رفع نیازهای شما با شما همکاری خواهیم کرد.

در مورد خواندن:

به اشتراک گذاری گزارش اعتبار سنجی کیت الایزا RNA دو رشته ای (dsRNA) برای ارتقای استانداردسازی تشخیص dsRNA.

مراجع:

[1] سوزا آر، موکرجی اس. T7 RNA پلیمراز [J]. پیشرفت در تحقیقات اسید نوکلئیک و زیست شناسی مولکولی، 2003: 1-41.

[2] Steitz T A. تغییرات ساختاری T7 RNA پلیمراز از شروع رونویسی تا ازدیاد طول [J]. نظر فعلی در زیست شناسی ساختاری، 2009، 19(6): 683-690.

[3] Vallejo D، Nikoomanzar A، Paegel BM، و همکاران. مرتب‌سازی قطره‌ای فعال شده با فلورسانس برای تکامل تک سلولی [J]. زیست شناسی مصنوعی ACS، 2019، 8 (6): 1430-1440.

[4] Gholamalipour Y، Karunanayake Mudiyanselage A، Martin C T. 3' اضافات انتهایی توسط T7 RNA پلیمراز، RNA خود قالبی، توزیعی و متنوع در کاراکتر-RNA-Seq آنالیز [J] هستند. تحقیقات اسیدهای نوکلئیک، 2018، 46(18): 9253-9263.

[5] دوسیس A، راویچاندران کی، هوبرت EM، و همکاران. یک RNA پلیمراز T7 مهندسی شده که mRNA عاری از محصولات جانبی تحریک کننده ایمنی تولید می کند [J]. بیوتکنولوژی طبیعت، 2023، 41 (4): 560-568.