به اشتراک گذاری گزارش اعتبار سنجی کیت ELISA دو رشته RNA (DSRNA) برای ترویج استاندارد سازی تشخیص DSRNA.

آیا به دنبال راهی مطمئن برای تشخیص dsRNA باقیمانده در طول رونویسی mRNA در شرایط آزمایشگاهی هستید؟ به کیت الایزای RNA دو رشته ای (dsRNA) نگاه نکنید. با این حال، با چند کیت تجاری موجود، توجه به این نکته مهم است که داده های اعتبارسنجی ممکن است همیشه در دسترس عموم نباشد، که منجر به ناسازگاری در تشخیص dsRNA می شود. به همین دلیل است که ما گزارش اعتبارسنجی کیت الایزا RNA دو رشته ای (dsRNA) را به اشتراک می گذاریم که ویژگی، دقت، دقت، حساسیت و دوام را پوشش می دهد. این گزارش به عنوان یک راهنمای مرجع برای تأیید روش‌های تشخیص باقی‌مانده dsRNA متناسب با شرایط آزمایشی خاص و استانداردهای داروسازی نظارتی عمل می‌کند. لطفاً درباره گزارش اعتبارسنجی ما بیشتر بدانید برای ارتقای استانداردسازی تشخیص dsRNA.

الایزا RNA دو رشته ای (dsRNA). کآن را

پس زمینه:

کیت الایزا RNA دو رشته ای (dsRNA) یک کیت معرف است که برای شناسایی باقیمانده dsRNA تولید شده در طول فرآیند رونویسی mRNA در شرایط آزمایشگاهی طراحی شده است. این کیت با استفاده از اصل آزمایشی سنجش ایمونوسوربنت متصل به آنزیم دوگانه آنتی بادی (ELISA) و سیستم تقویت بیوتین-استرپتاویدین، تشخیص حساس dsRNA باقیمانده را در نمونه ها ارائه می دهد.

داده‌های خلاصه شامل پارامترهای اعتبارسنجی است که ویژگی، دقت، دقت، حساسیت و دوام را پوشش می‌دهد. این گزارش به عنوان یک راهنمای مرجع عمل می‌کند و از کاربران می‌خواهد تا روش‌های تشخیص باقی‌مانده dsRNA متناسب با شرایط آزمایشی خاص آنها و رعایت استانداردهای دارویی نظارتی را تأیید کنند.

مواد و روش ها:

کیت: کیت الایزا RNA دو رشته ای (dsRNA): Cat#36717ES (YEASEN). این کیت شامل چهار نوع مجزا از نمونه های استاندارد dsRNA است. کاربران این امکان را دارند که نوع نمونه استانداردی را انتخاب کنند که با فرآیند خاص آنها برای تولید منحنی استاندارد مطابقت دارد و در نتیجه از تهیه و آزمایش همه نمونه ها جلوگیری می کند.

روش‌ها: مواد و مراحل رویه‌ای ضروری برای آزمایش عمدتاً توسط Yeasen Biotechnology مشخص شده‌اند. این کیت تحت آزمایش و ارزیابی گسترده قرار گرفته است و اطمینان حاصل می کند که عملکرد آن با الزامات تعیین شده ICH Q2 (R1) و نسخه 2020 بخش چهارم فارماکوپه چینی "راهنماهای اعتبارسنجی روش تحلیلی 9101" مطابقت دارد.

نتایج

  1. خطی بودن استانداردهای dsRNA

این گزارش منحنی های استانداردی را برای هر چهار نوع متمایز استانداردهای dsRNA، که هر کدام با طول 300 جفت باز هستند، ایجاد کرده است. این استانداردها عبارتند از STD1، dsRNA اصلاح نشده. STD2، dsRNA اصلاح شده با شبه UTP. STD3، dsRNA اصلاح شده N1-Me-Pseudo-UTP. و STD4، dsRNA اصلاح شده با 5-OMe-UTP. هر نوع استاندارد dsRNA خطی عالی رقت را با R2 > 0.99 و ضریب تغییرات (CV) غلظت اندازه گیری شده کمتر از 10٪ نشان داده شده در جدول 1 تا جدول 5 نشان می دهد.

نام STD

نوع UTP

خطی بودن رقت (ر2＞0.99)

CV

STD1

UTP

0.0156-1 pg/μL

＜10%

STD2

pUTP

0.0156-1 pg/μL

＜10%

STD3

N1-Me-pUTP

0.0312-1 pg/μL

＜10%

STD4

5-OMe-UTP

0.0625-1 pg/μL

＜10%

جدول 1. خطی بودن استانداردهای مختلف dsRNA.

STD1 concn. (pg/μL)

میانگین اندازه گیری شده (pg/μL)

بازیابی

CV

1

10001

100.0%

3.1٪

0.5

0.4994

99.9٪

2.4٪

0.25

0.2516

100.7%

3.3٪

0.125

0.1227

98.1٪

0.5٪

0.0625

0.0640

102.5٪

3.2٪

0.0312

0.0309

99.2٪

1.3٪

0.0156

0.0157

100.4%

3.2٪

0

/

/

/

جدول 2.ریکاوری و CV STD1 رقیق شده

STD2 concn. (pg/μL)

میانگین اندازه گیری شده (pg/μL)

بازیابی

CV

1

10001

100.0%

0.7٪

0.5

0.4994

99.9٪

0.1٪

0.25

0.2514

100.6%

0.9٪

0.125

0.1232

98.6٪

2.5٪

0.0625

0.0635

101.6٪

1.1٪

0.0312

0.0312

99.9٪

0.5٪

0.0156

0.0155

99.6٪

0.0٪

0

/

/

/

جدول 3. بهبود و CV STD2 رقیق شده

اتصال STD3 (pg/μL)

میانگین اندازه گیری شده (pg/μL)

بازیابی

CV

2

2.0031

100.2%

1.6%

1

0.9880

98.8٪

2.4٪

0.5

0.5188

103.8٪

1.2٪

0.25

0.2383

95.3٪

2.2٪

0.125

0.1242

99.4٪

0.1٪

0.0625

0.0629

100.7%

1.8٪

0.0312

0.0361

115.7٪

1.6٪

0

/

/

/

جدول 4. بهبود و CV STD3 رقیق شده

اتصال STD4 (pg/μL)

میانگین اندازه گیری شده (pg/μL)

بازیابی

CV

4

4.0096

100.2%

1.9٪

2

1.9940

99.7٪

0.7٪

1

0.9977

99.8٪

0.1٪

0.5

0.5108

102.2%

0.1٪

0.25

0.2454

98.2٪

5.6٪

0.125

0.1207

96.5٪

2.8٪

0.0625

0.0624

99.9٪

0.3٪

0

/

/

/

جدول 5. بهبود و CV STD4 رقیق شده

  1. خاص بودن

  • تجزیه و تحلیل ویژگی با dsRNA، ssRNA، dsDNA و ssDNA.
شکل 1. کیت منحصراً dsRNA را شناسایی می کند و ssRNA، dsDNA یا ssDNA را شناسایی نمی کند.

  • ویژگی تحت تاثیر طول dsRNA ها قرار نگرفت.
شکل 2. ویژگی کیت در سراسر dsRNA ها با طول های مختلف (160 جفت باز و 500 جفت باز) ثابت می ماند.

  1. الفدقت

افزودن 0.5 pg/μL STD1 به یک نمونه mRNA شناخته شده با محتوای dsRNA 0.36 pg/μL در سه نسبت حجمی مختلف (1:1، 1:20، 1:250) انجام شد. در همه موارد، نرخ بازیابی سنبله در محدوده 80-120٪ کاهش یافت.

نرخ بازیابی سنبله به صورت زیر محاسبه می شود: سنبله بازیابی Rate=(اندازه گیری شد تمرکز بعد از spiking×مجموع حجم از میخ دار نمونه - اندازه گیری شده تمرکز از را نمونه×مجموع حجم از را نمونه)/(نظری تمرکز از را سنبله×حجم از را سنبله)×100%

نمونه ها

نسبت حجم STD1/نمونه

dsRNA اندازه گیری شد (pg/μL)

سنبله بازیابی امتیاز دهید

نمونه (TS)

/

0.36

/

TS + 0.5 pg/μL STD1

1:1

0.769

81%

TS + 0.5 pg/μL STD1

1:20

0.777

82%

TS + 0.5 pg/μL STD1

1:250

0.803

82%

جدول 6. نرخ بازیابی سنبله تجزیه و تحلیل

  1. دقت

  • دقت درون سنجش

آزمایش‌ها در سه سطح غلظت (بالا، متوسط ​​و کم) برای هر یک از چهار نمونه استاندارد dsRNA انجام شد. در یک آزمایش واحد، هر نمونه غلظتی تحت هشت آزمایش مکرر قرار گرفت. نتایج نشان می دهد که ضریب تغییرات (CV) زیر 15 درصد است. نشان دهنده دقت درون سنجش خوب است.

STD1

نظری ادغام (pg/μL)

تکرار می شود

میانگین اندازه‌گیری شده (pg/μL)

CV

1

8

10002

3.11٪

0.125

8

0.1230

0.46٪

0.0156

8

0.0164

3.18٪

STD2

نظری ادغام (pg/μL)

تکرار می شود

میانگین اندازه‌گیری شده (pg/μL)

CV

1

8

10001

0.65٪

0.125

8

0.1231

2.46٪

0.0156

8

0.0162

0.02٪

STD3

نظری ادغام (pg/μL)

تکرار می شود

میانگین اندازه‌گیری شده (pg/μL)

CV

2

8

2.0022

1.58٪

0.25

8

0.2444

2.17٪

0.0312

8

0.0328

1.64٪

STD4

نظری ادغام (pg/μL)

تکرار می شود

میانگین اندازه‌گیری شده (pg/μL)

CV

8

8

8.0803

0.27٪

1

8

0.9650

0.12٪

0.125

8

0.1322

2.76%

جدول 7. تجزیه و تحلیل دقیق درون سنجش

  • دقت بین سنجش

سه آزمایش با استفاده از کیت های 3 انجام شد دسته ها در هر آزمایش، غلظت‌های بالا، متوسط ​​و پایین سه بار برای هر یک از چهار نمونه استاندارد dsRNA با هشت تکرار انتخاب و مورد آزمایش قرار گرفتند. در نتیجه، 24 نقطه داده در هر یک به دست آمد سطح غلظت، که سپس برای تجزیه و تحلیل ضریب تغییرات (CV) مورد استفاده قرار گرفت.

STD1

نظری ادغام (pg/μL)

تست های مستقل / تکرار

میانگین اندازه‌گیری شده (pg/μL)

CV

1

3/8

1.0007

2.38٪

0.125

3/8

0.1186

3.20٪

0.0156

3/8

0.0173

1.27٪

STD2

نظری ادغام (pg/μL)

تست های مستقل / تکرار

میانگین اندازه‌گیری شده (pg/μL)

CV

1

3/8

0.9987

0.09٪

0.125

3/8

0.1269

1.06٪

0.0156

3/8

0.0151

0.52٪

STD3

نظری ربط (pg/μL)

تست های مستقل / تکرار

میانگین اندازه‌گیری شده (pg/μL)

CV

2

3/8

2.0012

2.37٪

0.25

3/8

0.2415

0.14٪

0.0312

3/8

0.0330

1.81٪

STD4

نظری ربط (pg/μL)

تست های مستقل / تکرار

میانگین اندازه‌گیری شده (pg/μL)

CV

8

3/8

7.9735

1.89٪

1

3/8

1.0225

0.13٪

0.125

3/8

0.1227

5.63٪

جدول 8. تجزیه و تحلیل دقیق بین سنجش

  1. حساسیت

  • LOD

حد تشخیص از کیت با افزودن دو برابر انحراف معیار به میانگین مقادیر خالی تعیین می شود. با اندازه گیری OD 24 جای خالی، محاسبه میانگین و انحراف معیار آنها و سپس اعمال این مقادیر بر روی منحنی برازش، حد تشخیص مربوطه بدست می آید.

OD

dsRNA استاندارد

میانگین خالی

SD از خالی

میانگین Blank+2SD

LOD

STD1

0.016

0.00048

0.01696

≤0.001 pg/μL

STD2

0.016

0.00072

0.01744

≤0.001 pg/μL

STD3

0.034

0.00119

0.03638

≤0.001 pg/μL

STD4

0.115

0.00290

0.1208

≤0.01 pg/μL

جدول 9. تجزیه و تحلیل LOD

  • LOQ

حد کمی از کیت با رقیق کردن پایین ترین نقطه غلظت منحنی استاندارد به سطوح حتی پایین تر، تضمین CV < 20٪ در کمترین غلظت، و در نتیجه تعیین آستانه کمی ایجاد می شود. LOQ به صورت زیر است.

dsRNA استاندارد

LOQ

تکرار می شود

CV(%)

بازیابی (%)

STD1

0.0156 pg/μL

24

＜10%

80 تا 120 درصد

STD2

0.0312 pg/μL

24

＜10%

80 تا 120 درصد

STD3

0.0156 pg/μL

24

＜10%

80 تا 120 درصد

STD4

0.125 pg/μL

24

＜10%

80 تا 120 درصد
جدول 10.تجزیه و تحلیل LOQ

  1. دیقابل استفاده بودن

  • ضد تداخل در مواد IVT

این تست با هدف ارزیابی تاثیر آنزیم های مختلف، بافرها و غیره اضافه شده به mRNA نمونه بر روی تشخیص dsRNA توسط کیت.

افزودن غلظت‌های خاص از RNA پلیمراز T7، بازدارنده RNAse، IPPA (پیروفسفاتاز معدنی)، DNase I، VCE (آنزیم پوشاننده واکسن)، 2'-O-متیل ترانسفراز (MT)، بافر 1×IVT، و 1 میلی‌مولار سیترات سدیم به یک نمونه mRNA ارائه شده با استفاده از mRNA به صورت utilizing و subsetting. هم برای تهیه منحنی استاندارد و هم برای آزمایش نمونه، ارزیابی توانایی کیت برای تشخیص محتوای dsRNA در اینها را فعال کرد. نمونه ها نتایج نشان می‌دهد که حضور هشت آنزیم و بافر مختلف بر تشخیص دقیق dsRNA تأثیری ندارد. علاوه بر این، نرخ بازیابی مشاهده شده در محدوده 80٪ تا 120٪ کاهش یافت.

مواد IVT

dsRNA اندازه گیری شده (pg/μL)

بازیابی

هیچ کدام

0.6057

100%

T7 RNA پلیمراز (15μg/mL)

0.5411

89.32٪

مهارکننده RNase موش (27.5μg/mL)

0.5142

84.88٪

پیروفسفاتاز غیر آلی (IPPA 10μg/mL)

0.7132

117.7%

DNase I (13.75μg/mL)

0.6077

100.32%

آنزیم پوشاننده واکسینیا (10μg/mL)

0.6563

108.3٪

2'-O-متیل ترانسفراز (10μg/mL)

0.5776

95.4٪

بافر 1×IVT

0.5003

82.6٪

1 میلی متر سیترات سدیم

0.6251

103.2٪

جدول 11. بازیابی STD3 رقیق شده اضافه شده با مواد IVT

  • دما دقابل استفاده بودن

کیت ها در هر دو ذخیره شده بودند 4 درجه سانتی گراد و 37 درجه سانتی گراد برای تشخیص واریانس غلظت استاندارد dsRNA بعد از 7 روز. نتایج نشان می دهد که واریانس ها همه در محدوده 20 درصد هستند.

dsRNA استاندارد

dsRNA اندازه گیری شده (pg/μL) روز 0

واریانس ها بعد از 7 روز در دمای 4 درجه سانتیگراد

STD1

1

10%

STD2

1

5%

STD3

2

7%

STD4

4

11%

dsRNA استاندارد

dsRNA اندازه‌گیری شده (pg/μL)

واریانس ها پس از 7 روز در دمای 37 درجه سانتیگراد

STD1

1

18%

STD2

1

4%

STD3

2

5%

STD4

4

8%

جدول 12. تجزیه و تحلیل دوام دما


      محصول مرتبط:

      نام محصول SKU مشخصات
      کیت الایزا RNA دو رشته ای (dsRNA). 36717ES 48T/96T
      CleaScrip™ T7 RNA پلیمراز ( ds RNA کم، 250 U/μL) 10628ES 10/100 KU
      T7 RNA پلیمراز درجه GMP (250 U/μL) 10625ES 10/100 KU

      مطالب مرتبط:

      کیت الایزای RNA دو رشته ای (dsRNA) برای اعتبارسنجی جهش یافته های پلیمراز RNA T7 dsRNA کم، در ارتباط با روش نقطه بلات آنتی بادی J2 استفاده شد.

      جهش‌یافته‌های پلیمراز RNA T7 با dsRNA کم، واکسن و درمان mRNA توانمند


      مراجع:

      1. ICH، 2022: اعتبارسنجی روش تحلیلی Q2، نسخه پیش نویس.
      2. NMPA، 2007: اصول کلی برای ارزیابی اعتبارسنجی روش تحلیلی برای تجزیه و تحلیل کنترل کیفیت محصول بیولوژیکی
      3. کمیسیون فارماکوپه چین (ChPC)، 2020: فارماکوپه چینی، بخش چهارم: دستورالعمل هایی برای اعتبارسنجی روش های تجزیه و تحلیل کمی برای نمونه های بیولوژیکی

      تحقیق